Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

A "programozott sejthalál" (apoptosis) in vivo körülmények közötti kimutatását célzó peptid előállítása és jelzése 99m Tc-radionukliddal Szemenyei Erzsébet.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "A "programozott sejthalál" (apoptosis) in vivo körülmények közötti kimutatását célzó peptid előállítása és jelzése 99m Tc-radionukliddal Szemenyei Erzsébet."— Előadás másolata:

1 A "programozott sejthalál" (apoptosis) in vivo körülmények közötti kimutatását célzó peptid előállítása és jelzése 99m Tc-radionukliddal Szemenyei Erzsébet 1, Tóth Géza 1, Környei József 2 Őszi Radiokémiai Napok Eger MTA SZBK, Biokémiai Intézet, Szeged, 2 Izotóp Intézet Kft. Budapest

2 Apoptózis: Programozott sejthalál. A természetes sejthalál egyik formája, a sejtek mindig ugyanazon a helyen és időben genetikailag meghatározott program szerint halnak el. Az elnevezés a régi görög nyelvből származik, ahol falevelek hullását jelentette. Az elhaló sejtek felszínén, a kettős membrán külső odalán megjelennek ezen sejtek felismerését lehetővé tévő molekulák, pl. a foszfatidil-szerin lipid-molekula. Bevezetés

3 Annexin V: Ca 2+ és foszfolipid kötő fehérjék családjának tagja, antikoaguláns tulajdonságokkal Nagyrészt a plazmamembrán citoszol felőli részén található Az érett annexin V 320 aminosavból áll, kDa tömegű A fehérje négy ismétlődő rész, síkban ciklikus elrendeződésével alakul ki, az ismétlődő részek öt alfa-helikális szegmenst tartalmaznak Patrick Raynal, Harvey B. Pollard (1994) Biochimica et Biophysica Acta 1197,

4 Annexin V fragmentum szintézise A szintézis lépései: 1. Kapcsolás: 2 ekv. Boc-Xaa, 2 ekv. HOBt, 2 ekv. DCC, DCM 2. Védőcsoport eltávolítás: 50 % TFA/DCM, 10 % DIEA/DCM 3. A következő aminosav(ak) kapcsolása 4. Hasítás: HF(l), anizol, dimetil-szulfid, 0 ˚C ANX13: 1. Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH /AQVLRGTVTDFPG-OH/ 2. Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH 2 /AQVLRGTVTDFPG-NH 2 / Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis Alkalmazott gyanták, szintézis módszerek: 1. Merrifield-gyanta, Boc-kémia 2. 4-metil-benzhidril-amin gyanta, Boc-kémia

5 Analitikai adatok PeptidekMr MSHPLC [M+H + ] k` AQVLRGTVTDFPG -OH 1359, ,75 4,35 AQVLRGTVTDFPG -NH , ,68 3,17 Tiszítás: (RP-HPLC, gradiens elúció) Vydac 218TP1010 (C18) oszlop, Gradiens:15 %-40 % A /25 perc A: acetonitril, B: víz (0,1% TFA), 4 cm 3 /perc Analitikai tisztaság vizsgálata: (RP-HPLC) Vydac 218TP54 (C18) oszlop, Gradiens:15 %-40 % A /25 perc A: acetonitril, B: víz (0,1% TFA), 1 cm 3 /perc Tömegspektrum adatok: Reflex III MALDI-TOF Kitermelés: AQVLRGTVTDFPG -OH: 20,4 % AQVLRGTVTDFPG -NH 2 :49,6 %

6 Stabilitás vizsgálat Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH, 12 hónap, -18 °C A vizsgálat kezdete Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH 2, 12 hónap, -18 °C Vydac 218TP54 (250  4.6 mm), 215 nm, gradiens: 15 %-40 % ACN/25 perc, injektálás: 50 μl A vizsgálat kezdete

7 CCANX13 szintézise, stabilitás vizsgálata CCANX13: Cys-Cys-Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH /CCAQVLRGTVTDFPG-OH/ Alkalmazott szintézis módszer, gyanta: Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis, Boc-kémia, Merrifield-gyanta Analitikai adatok: PeptidMr MSHPLC [M+H + ] k` CCAQVLRGTVTDFPG -OH 1565, ,92 7,46 Kitermelés = 59,1 % Hővel szembeni stabilitás vizsgálata: 100 °C-on, fiziológiás sóoldatban hőkezelés nélküli20 perc1 óra

8 „Nitrido-jelzés” 1. -intermedier előállítása SnCl 2 TcO 4 - szobahőmérséklet keverés -komplex előállítása (Oldás: hidroxpropil-  -cikodextrin jelenlétében) + + CCANX °C 1 óra 15 perc 99m Tc-ANX13 2.

9 Analitikai vizsgálatok 99m Tc-ANX13-PCN-komplex ET-31 aceton 99m Tc-ANX13-PCN-komplex Kieselgel 60, F 254 EtOH:víz 1:1 Vékonyréteg-kromatográfia Rf érték:0,03100%Rf értékek:0,02 4,22% 0,6695,78%

10 Analitikai vizsgálatok 99m Tc-ANX13-PCN-komplex Kieselgel 60, F 254 EtOH:víz 1:1 99m Tc  N-intermedier Kieselgel 60, F 254 EtOH:víz 1:1 99m Tc-PCN-komplex Kieselgel 60, F 254 EtOH:víz 1:1 Rf érték:(3)0,15100% Rf értékek:(4)0,1512,97% 0,7187,03% Rf értékek:(5)0,15 8,72% 0,7391,28% 4 5 3

11 Analitikai vizsgálatok 99m Tc  N-intermedier ITLC-SA 0,3 M-os HCl-val telített BuOH 99m Tc-ANX13-PCN-komplex ITLC-SA 0,3 M-os HCl-val telített BuOH 99m Tc-PCN-komplex ITLC-SA 0,3 M-os HCl-val telített BuOH Rf értékek:(8) 0,1411,81% 0,4941,72% 0,5231,73% 0,5514,74% Rf értékek:(7) 0,1513,99% 0,3819,91% 0,50 4,84% 0,6114,22% 0,6747,05% Rf értékek:(6) 0,1527,53% 0,2248,59% 0,49 4,71% 0,6619,17% 67 8

12 Összefoglalás Sikeresen előállítottuk a Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH és Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH 2 peptideket. A stabiltás vizsgálatból kiderült, hogy az –OH végű forma stabilabb, ezért a további vizsgálatokat ezzel végeztük. Elkészítettük a nitrido-jelzéshez szükséges, két ciszteinnel kiegészített ANX13-at, ennek hővel szembeni stabilitás eredménye azt mutatja, hogy a jelzésnél alkalmazhatjuk az 1 órás reakcióidőt. A jelzési reakció után vékonyréteg-kromatográfiával kimutattuk, hogy nincs szabad 99m TcO 4 - a rendszerben. (ET-31, aceton) A további vizsgálatok azt mutatták, hogy intermedier sincs jelen. (Kieselgel 60, EtOH: víz 1:1) Ugyanakkor, ebben a rendszerben nem válik el egyértelműen a 99m Tc-PCN-komplex és a 99m Tc-ANX13-PCN-komplex. Egy újabb futtatórendszeren és lapon elvégzett vizsgálatokból egyértelműen látszik, hogy a jelzés sikeres volt. (ITLC-SA, 0,3 M HCl-val telített BuOH) Célunkat elértük, sikerült előállítanunk a 99m Tc-ANX13-komplexet, amely jelentős előrelépés egy tervezett radiogyógyszer kifejlesztésének következő fázisához, a preklinikai vizsgálatok megtervezéséhez.

13 Köszönetnyilvánítás Köszönöm a figyelmüket ! Szeretnék köszönetet mondani munkatársaimnak: Tóthné Papp Évának és Papp Jánosné, Andreának valamint Rupert Anikónak és Paál Margitnak a hatékony segítségért. Köszönjük a Nemzetközi Atomenergia Ügynökség támogatását.


Letölteni ppt "A "programozott sejthalál" (apoptosis) in vivo körülmények közötti kimutatását célzó peptid előállítása és jelzése 99m Tc-radionukliddal Szemenyei Erzsébet."

Hasonló előadás


Google Hirdetések