ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI.

Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI."— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI.
ELEKTROFORÉZIS Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2 DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS
ELEKTROMIGRÁCIÓ SZABAD HATÁRFELÜLETŰ (ZÓNA) GÉLELEKTROFORÉZIS DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS

3 Arne TISELIUS professzor

4

5

6

7 TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Tiselius (1925 – 1930)
Szabad határfelületű (zóna) elektroforézis, 1948 Nobel-díj Elektroforézis hordozók bevezetése (1930 – 1950) - porok (cellulóz) - szűrőpapír - gélek (hidrolizált keményítő, agar-agar, agaróz, agaropektin) - membránok (cellulóz acetát) Poliakrilamid gélek (1950 – 1960) - pórusméret, molekulaszűrés, gradiens technikák - készülék fejlesztések (slab – disc, horizontális – vertikális) Detergens gélelektroforézis, SDS-PAGE (1960 – 1970) - Izoelektromos fokuszálás Kapilláris elektroforézis és kapcsolt technikák 1990 – től - CZE, CGE, MEKC, CIEF, CITP, ACE, CEC

8 AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI
ELVÁLASZTÁS ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN TÖLTÉSSEL RENDELKEZŐ MOLEKULÁK ELTÉRŐ ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁSA ALAPJÁN AZ ELVÁLASZTÁS TÉNYEZŐI AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR

9 AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI
AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI ELEKTROMOS TÖLTÉSSEL RENDELKEZZEN (POZITÍV, VAGY NEGATÍV, IZOELEKTROMOS PONT, pI), IONIZÁLHATÓ (INDUKÁLHATÓ), VAGY IONOS ÁLLAPOTBA HOZHATÓ (detergens micella) LEGYEN, KÉMIAI SZERKEZETE (stabilitás), FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI (disszociáció, erős – gyenge) KÖLCSÖNHATÁSAI (aggregáció, asszociáció) MÉRETE – TÖMEGE (kis molekulák – biopolimerek – fehérjék) ALAKJA (globuláris – fibrilláris) BELSŐ VISZKOZITÁS (konformáció) OLDÉKONYSÁG, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS

10 IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK
A FEHÉRJÉK MOLEKULA SZERKEZETÉBEN

11 A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE
A molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggése (eltérése) a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

12 AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI
AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) HALMAZÁLLAPOTA Folyadék (szabad határfelületű, vagy zónális), Szilárd (cellulóz – papír, szemcsék, membránok) Félfolyékony rendszerek (gélek, hidrofil polimerek) MINŐSÉGE Polaritás, dielektromos állandó, oldószer erősség, Viszkozitás, Hőmérséklet (hűtés !), ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK Ionerősség – ion minőség, pH (puffer)

13 AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

14 TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

15 N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

16 AZ ELEKTROFORÉZIS TECHNIKÁKBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT PUFFER RENDSZEREK
pH tartomány Citrát (-dihidrogén, -hidrogén) 2 - 6, ,6 - 6,5 Dietil barbiturát (Veronál-Na) 7,0 - 10 Kálium hidrogén ftalát 2,2 - 6,5 Nátrium formiát 3,0 - 4,4 Nátrium acetát 4,2 - 5,4 Trietanolamin 6,7- 8,7 Nátrium borát 8,0 - 9,8 Ammónium acetát 8,6-9,8 Nátrium dihidrogén foszfát 2,0-6,0 és 8,0-12,0 Kálium dihidrogén foszfát 2,0-8,0 és 9,0-13,0 Bis-tris-propán 4.0 – 8.0

17 ELEKTROFORÉZIS AZ ELEKTROFORÉZIS KÖZEGÉNEK JELLEMZŐI
IONERŐSSÉG (I) IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol: ci az i-edik ion koncentrációja, zi az i-edik ion töltés számának négyzete.

18 E = V . d-1 (Volt /m) Q = f (I) V = R . I Ohm – törvény Joule - hő
AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR JELLEGE – HOMOGENITÁSA Lineáris – radiális, síkban – térben, INTENZITÁSA E = V . d (Volt /m) AZ ELEKTROMOS ÁRAMKÖR Ohm – törvény Joule - hő V = R . I Q = f (I)

19 = a molekula összetett paramétere, ~10-8 (előjel – irány)
AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI VÁNDORLÁSI SEBESSÉG () ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS ()  (Volt-1sec-1m2) t idő (sec) = a molekula összetett paramétere, ~ (előjel – irány) „net charge” - eredő (össz) töltés, ionizáltsága (erössége-foka) anyagi minősége, hidrodinamikai ellenállása, közeg viszkozitása, ionerőssége-ion minősége, pH-ja, speciális vezetőképessége STOKES-féle törvény frikciós együttható (f) i = qi / 6r f = 6r

20

21 AZ ELEKTROFORÉZIS GYAKORLATA
Analitikai – preparatív (oszlop, réteg) Horizontális - vertikális Disc - slab - kapilláris Kontinuus - diszkontinuus Detergens gélelektroforézis (SDS - PAGE) Moltömeg (méret) meghatározás Izoelektromos fókuszálás (IEF), pl

22 SZABAD HATÁRFELÜLETŰ „ZÓNA” (agaróz, dextrán, poliakril amid)
Tiselius (1948) Nobel-díj SZABAD HATÁRFELÜLETŰ „ZÓNA” ELEKTROFORÉZIS HORIZONTÁLIS papír keményítő membrán (cellulóz acetát) GÉL (agaróz, dextrán, poliakril amid) ELEKTROFORÉZIS H

23 HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA „KLASSZIKUS” PAPÍRELEKTROFORÉZISSEL
LDL HDL ( + )

24 HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM) CHYLOMICRON VLDL

25 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA
ELFO VLDL LDL HDL UC

26 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN
FESTÉS Sudan Black B

27

28 HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

29 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ÉS LIPIDEK ÖSSZEHASONLÍTÓ DIAGNOSZTIKAI VIZSGÁLATA

30 ELŐFESTETT EGÉR SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL VLDL LDL HDL

31 GÉLELEKTROFORÉZISSEL
FEHÉRJÉK MOLEKULATÖMEG MEGHATÁROZÁSA VERTIKÁLIS (SLAB) PÓRUS-GRADIENS SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL LMW STANDARD FEHÉRJÉK

32 EHRLICH ASCITES TUMORSEJT MEMBRÁN FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL

33 DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS COOMASSIE BRILLANT BLUE
HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS GLIKOPROTEINEK DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS (SDS-PAGE) VIZSGÁLATA FESTÉS COOMASSIE BRILLANT BLUE PERJODÁT-SCHIFF (PAS) AGP

34 HUMÁN SZÉRUM AGP GENETIKAI VARIÁNSAINAK ELVÁLASZTÁSA
IZOELEKTROMOS FOKUSZÁLÁSSAL (IEF GÉLELEKTROFORÉZIS) F1 S A O O L NP - XXII pI 4, ,03 5,06

35 HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA
HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

36 LDH H ~ MÁJ (HEPAR) M ~ IZOM (MUSCLE)
AZ LDH IZOENZIMEK TETRAMER SZERKEZETE ALEGYSÉGEK H ~ MÁJ (HEPAR) M ~ IZOM (MUSCLE)

37 LDH AZ LDH in situ KIMUTATÁSÁNAK SZINREAKCIÓJA TEJSAV + NAD
PIROSZŐLŐSAV + NADH FENAZIN METOSZULFÁT NADH + TETRAZÓLIUMKÉK NAP + FORMAZÁN

38 KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK

39 KÜLÖNBÖZŐ KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK
DENZITOMETRIÁS KIÉRTÉKELÉSE

40