Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI. ELEKTROFORÉZIS Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI. ELEKTROFORÉZIS Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest."— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI. ELEKTROFORÉZIS Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2 ELEKTROFORÉZISELEKTROMIGRÁCIÓ SZABAD HATÁRFELÜLETŰ (ZÓNA)ELEKTROFORÉZISGÉLELEKTROFORÉZIS DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS

3 Arne TISELIUS professzor

4

5

6

7 TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Tiselius (1925 – 1930) Szabad határfelületű (zóna) elektroforézis, 1948 Nobel-díj Elektroforézis hordozók bevezetése (1930 – 1950) - porok (cellulóz) - szűrőpapír - gélek (hidrolizált keményítő, agar-agar, agaróz, agaropektin) - membránok (cellulóz acetát) Poliakrilamid gélek (1950 – 1960) - pórusméret, molekulaszűrés, gradiens technikák - készülék fejlesztések (slab – disc, horizontális – vertikális) Detergens gélelektroforézis, SDS-PAGE (1960 – 1970) - Izoelektromos fokuszálás Kapilláris elektroforézis és kapcsolt technikák 1990 – től - CZE, CGE, MEKC, CIEF, CITP, ACE, CEC

8 AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR AZ ELVÁLASZTÁS TÉNYEZŐI AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI ELVÁLASZTÁS ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN TÖLTÉSSEL RENDELKEZŐ MOLEKULÁK ELTÉRŐ ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁSA ALAPJÁN

9 AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI ELEKTROMOS TÖLTÉSSEL RENDELKEZZEN (POZITÍV, VAGY NEGATÍV, IZOELEKTROMOS PONT, pI), IONIZÁLHATÓ (INDUKÁLHATÓ), VAGY IONOS ÁLLAPOTBA HOZHATÓ (detergens micella) LEGYEN, KÉMIAI SZERKEZETE (stabilitás), FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI (disszociáció, erős – gyenge) KÖLCSÖNHATÁSAI (aggregáció, asszociáció) MÉRETE – TÖMEGE (kis molekulák – biopolimerek – fehérjék) ALAKJA (globuláris – fibrilláris) BELSŐ VISZKOZITÁS (konformáció) OLDÉKONYSÁG, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI

10 IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK A FEHÉRJÉK MOLEKULA SZERKEZETÉBEN

11 A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggése (eltérése) a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

12 AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) HALMAZÁLLAPOTA Folyadék (szabad határfelületű, vagy zónális), Szilárd (cellulóz – papír, szemcsék, membránok) Félfolyékony rendszerek (gélek, hidrofil polimerek) MINŐSÉGE Polaritás, dielektromos állandó, oldószer erősség, Viszkozitás, Hőmérséklet (hűtés !), ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK Ionerősség – ion minőség, pH (puffer)

13 AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

14 TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

15 N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

16 AZ ELEKTROFORÉZIS TECHNIKÁKBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT PUFFER RENDSZEREK PufferpH tartomány Citrát (-dihidrogén, -hidrogén) 2 - 6,0 2,6 - 6,5 Dietil barbiturát (Veronál-Na) 7, Kálium hidrogén ftalát 2,2 - 6,5 Nátrium formiát 3,0 - 4,4 Nátrium acetát 4,2 - 5,4 Trietanolamin 6,7- 8,7 Nátrium borát 8,0 - 9,8 Ammónium acetát 8,6-9,8 Nátrium dihidrogén foszfát 2,0-6,0 és 8,0-12,0 Kálium dihidrogén foszfát 2,0-8,0 és 9,0-13,0 Bis-tris-propán 4.0 – 8.0

17 ELEKTROFORÉZIS AZ ELEKTROFORÉZIS KÖZEGÉNEK JELLEMZŐI IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol: c i az i-edik ion koncentrációja, z i 2 az i-edik ion töltés számának négyzete.

18 AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR JELLEGE – HOMOGENITÁSA Lineáris – radiális, síkban – térben, INTENZITÁSA E = V. d -1 (Volt /m) AZ ELEKTROMOS ÁRAMKÖR Ohm – törvény Joule - hő V = R. I Q = f (I)

19 AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI VÁNDORLÁSI SEBESSÉG ( ) ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS (  )  (Volt -1 sec -1 m 2 ) t idő (sec)  = a molekula összetett paramétere, ~10 -8 (előjel – irány) „net charge” - eredő (össz) töltés, ionizáltsága (erössége-foka) anyagi minősége, hidrodinamikai ellenállása, közeg viszkozitása, ionerőssége-ion minősége, pH-ja, speciális vezetőképessége STOKES-féle törvény frikciós együttható (f)  i = q i / 6  r f = 6  r

20

21 AZ ELEKTROFORÉZIS GYAKORLATA Analitikai – preparatív (oszlop, réteg) Horizontális - vertikális Disc - slab - kapilláris Kontinuus - diszkontinuus Detergens gélelektroforézis (SDS - PAGE) Moltömeg (méret) meghatározás Izoelektromos fókuszálás (IEF), pl

22 Tiselius (1948) Nobel-díj SZABAD HATÁRFELÜLETŰ „ZÓNA” ELEKTROFORÉZIS H HORIZONTÁLIS papír keményítő membrán (cellulóz acetát) GÉL (agaróz, dextrán, poliakril amid) ELEKTROFORÉZIS

23 HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA „KLASSZIKUS” PAPÍRELEKTROFORÉZISSEL LDL ( + ) HDL

24 CHYLOMICRON VLDL HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM)

25 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA VLDL LDL HDL ELFO UC

26 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN FESTÉS Sudan Black B

27

28 HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

29 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ÉS LIPIDEK ÖSSZEHASONLÍTÓ DIAGNOSZTIKAI VIZSGÁLATA

30 ELŐFESTETT EGÉR SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL VLDL LDL HDL

31 FEHÉRJÉK MOLEKULATÖMEG MEGHATÁROZÁSA VERTIKÁLIS (SLAB) PÓRUS-GRADIENS SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL LMW MOLEKULATÖMEG STANDARD FEHÉRJÉK

32 EHRLICH ASCITES TUMORSEJT MEMBRÁN FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL

33 HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS GLIKOPROTEINEK DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS (SDS-PAGE) VIZSGÁLATA FESTÉS COOMASSIE BRILLANT BLUE PERJODÁT-SCHIFF (PAS) AGP

34 4,93 5,03 5,06 pI F1F1 S A NP - XXII L O O HUMÁN SZÉRUM AGP GENETIKAI VARIÁNSAINAK ELVÁLASZTÁSA IZOELEKTROMOS FOKUSZÁLÁSSAL (IEF GÉLELEKTROFORÉZIS)

35 HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

36 AZ LDH IZOENZIMEK TETRAMER SZERKEZETE ALEGYSÉGEK H ~ MÁJ (HEPAR) M ~ IZOM (MUSCLE)

37 TEJSAV + NAD LDH PIROSZŐLŐSAV + NADH FENAZIN METOSZULFÁT NADH + TETRAZÓLIUMKÉKNAP + FORMAZÁN AZ LDH in situ KIMUTATÁSÁNAK SZINREAKCIÓJA

38 KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK

39 KÜLÖNBÖZŐ KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK DENZITOMETRIÁS KIÉRTÉKELÉSE

40


Letölteni ppt "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI. ELEKTROFORÉZIS Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest."

Hasonló előadás


Google Hirdetések