ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I.

Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I."— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I.
MINTAELŐKÉSZÍTÉS ELMÉLETE, MŰVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2 KÉMIAI TUDOMÁNYOK SZERVETLEN – SZERVES KLASSZIKUS SZERVETLEN ÉS SZERVES ANALITIKAI KÉMIA BIOLÓGIA – BIOMOLEKULÁRIS KÉMIA BIOANALITIKA ELVÁLASZTÁSTECHNIKÁK ELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY

3 Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN PROTEOME (Wasinger et al
Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN PROTEOME (Wasinger et al. 1995)   „protein equivalent of a genom” „protein complement encoded by a given genom” PROTEOMICS - GENOMICS

4 PROTEOMICS (Wang és Hanasch, 2003) EXPRESSION PROTEOMICS  A genomban kódolt valamennyi fehérje azonosítása és mérése, Celluláris lokalizációjuk és poszt-transzlációs módosításuk meghatározása FUNCTIONAL PROTEOMICS   A FEHÉRJÉK KÖLCSÖNHATÁSAINAK VIZSGÁLATA AZ INDIVIDUÁLIS FEHÉRJÉK SZEREPÉNEK MEGHATÁROZÁSA A SPECIFIKUS ANYAGCSERE FOLYAMATOKBAN ÉS CELLULÁRIS STRUKTÚRÁKBAN A FEHÉRJÉK SZERKEZETÉNEK ÉS FUNKCIÓJÁNAK FELDERÍTÉSE

5 FUNKCIONÁLIS PROTEOMIKA
BIOMOLEKULÁRIS KÉMIA BIOPOLIMEREK MOLEKULA SZERKEZETÉNEK KUTATÁSA  ANOMÁLIS MOLEKULASZERKEZETEK KIMUTATÁSA  A FEHÉRJÉK POSZTTRANSZLÁCIÓS FOLYAMATAINAK ÉS MECHANIZMUSAINAK VIZSGÁLATA (GLIKOZILÁLÁS) GYAKORLATI CÉLOK – ALKALMAZOTT KUTATÁS DIAGNOSZTIKA - PROGNOSZTIKA - MARKEREK (PL. DAGANATOS MEGBETEGEDÉSEK FELISMERÉSE)

6 MINTA ELŐKÉSZITÉS ELVÁLASZTÁSI FELADATOK ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI
ELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY ELVÁLASZTÁSI FELADATOK MINTA ELŐKÉSZITÉS ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK EGYIDEJÜ ÉS ÖSSZEHANGOLT ALKALMAZÁS MULTIMODÁLIS – MULTIDIMENZIONÁLIS ANALITIKAI – PREPARATIV

7

8 AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI RENDSZER

9 ANALITICA EST ANCILLA CHEMIAE ?
Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN

10 ÁLTALÁNOS SZEMPONTOK ÉS KÖVETELMÉNYEK
MINTA ELŐKÉSZITÉS ÁLTALÁNOS SZEMPONTOK ÉS KÖVETELMÉNYEK A MINTA JELLEMZÉSE A VIZSGÁLANDÓ VEGYÜLET(EK) TULAJDONSÁGAINAK ISMERETE MOLEKULATÖMEG, ALAK, MINŐSÉG (Globuláris-fibrilláris, aggregáció, flexibilitás, belső viszkozitás), SZERKEZET, FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK, OLDÉKONYSÁG, SZOLVATÁCIÓ-HIDRATÁCIÓ, POLARITÁS, pKA, pKI HIDRODINAMIKAI JELLEMZŐK (Diffúziós állandó, Stokes-rádiusz), SPEKTROSZKÓPIAI ADATOK, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS (Enzimatikus, élettani, stb.) STABILITÁS (Fény, Hő, Idő) ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK (pI) IRODALMI ADATOK HASONLÓ SZERKEZETÜ ANYAGOKRA (ADATBÁZIS)

11 A BIOLÓGIAI KÖRNYEZET (MATRIX) JELLEGE
MINTA ELŐKÉSZITÉS A BIOLÓGIAI KÖRNYEZET (MATRIX) JELLEGE Kinyerhető-e a vizsgálandó anyag a változatlan mátrixból, Felszabadítható-e a szilárd fázisból, Csökkenthető-e a mátrix kötésének erőssége, (pl. higítás, pH, ionerősség, stb. változtatásával) Vannak-e jelen potenciális interferáló vegyületek. AZ INTERFERÁLÓ ANYAGOK VIZSGÁLATA A minta jellemzéséhez hasonlóan.

12 A MINTA ELŐKÉSZÍTÉS IGÉNYEI
MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZÍTÉS IGÉNYEI CLEAN UP SELECTIVE ENRICHMENT TISZTITÁS IGÉNYE felmerül-e ? (Specifikus detektálhatóság, interferáló anyagok?) TÖMÉNYITÉS IGÉNYE felmerül-e ? (Oldékonyság, detektálhatóság, ?) OLDÓSZER CSERE (váltás) igénye felmerül-e ? - Alkalmas-e az eluáló oldószer(elegy) a HPLC-re ? - Alkalmas-e a vizes elúció a detektálásnál ? - Szükséges-e más (illékony) oldószer alkalmazása ?

13

14 MINTA ELŐKÉSZITÉS FIZIKAI-MECHANIKAI MÜVELETEK MINTAVÉTEL
A MINTA ELŐKÉSZITÉS MÜVELETEI FIZIKAI-MECHANIKAI MÜVELETEK MINTAVÉTEL (Random, statisztikai, anatómiai heterogenitás, stb.) APRITÁS, ÖRLÉS, HOMOGENIZÁLÁS (Késes, Grinder, Potter, Dounce, Ultrahang) SZITÁLÁS, SZÜRÉS, ULTRASZÜRÉS, DIALIZIS CENTRIFUGÁLÁS - ULTRACENTRIFUGÁLÁS KIVONÁS (EXTRAKCIÓ), TÖMÉNYITÉS, SZÁRITÁS

15

16

17 MINTA ELŐKÉSZITÉS KÉMIAI MÜVELETEK HIGITÁS, IONERŐSSÉG, pH VÁLTOZTATÁS
A MINTA ELŐKÉSZITÉS MÜVELETEI KÉMIAI MÜVELETEK HIGITÁS, IONERŐSSÉG, pH VÁLTOZTATÁS HIDROLIZIS (Savas, lúgos, enzimatikus) SZÁRMAZÉK KÉPZÉS (Kromofor csoportok, polaritás változtatás, stb.) ADALÉKANYAGOK (Ion-pár képzés, detergensek, polaritás változtatás) SPECIÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK (Immuno-affinitás, zárvány-fém komplex)

18 AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA
MINTA ELŐKÉSZÍTÉS AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN Elektroforézis - Elektromigráció ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK GRAVITÁCIÓS ERŐTÉRBEN Centrifugálás – Ultracentrifugálás

19 EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK
MINTA ELŐKÉSZÍTÉS EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK SZITÁLÁS, SZŰRÉS, ULTRA(MOLEKULA)SZŰRÉS, DIALIZIS SZÁRÍTÁS (BEPÁRLÁS, VÁKUUM BEPÁRLÁS, FAGYASZTVA SZÁRÍTÁS) SZÉTKRISTÁLYOSÍTÁS (pl. diasztereomer sópárok) KIVONÁS – EXTRAKCIÓ GÁZ-GŐZ FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Vákuum, vagy vízgőz desztilláció, Gőztér (head space) analizis, Vivőgázzal (N2 Ar, He), Kriocsapdával (purge and trap) FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ SZUPERKRITIKUS ÁLLAPOTÚ (CO2, CS2) EXTRAKCIÓ

20 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS KIVONÁS – EXTRAKCIÓ
FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Megoszlási egyensúly létrehozása nem elegyedő oldószer (vizes!) fázisok között Szakaszos (pl. kirázás választótölcsérben), Folyamatos (ellenáramú, counter current) technikák FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Oldószeres, sós, savas kicsapás (precipitáció) Szilárd fázisból történő extrakció Soxhlet eljárás, Szilárd fázison történő extrakció SPE (Solid Phase Extraction)

21 AZ FOLYAMATOS ELLENÁRAMÚ FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ
Countercurrent Flow-Through Coil Centrifuge (Ito et al. 1971)

22 FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ OLDÓSZERES, SÓS, SAVAS KICSAPÁS
MINTA ELŐKÉSZÍTÉS FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ OLDÓSZERES, SÓS, SAVAS KICSAPÁS (PRECIPITÁCIÓ – BIOLÓGIAI MINTÁK) MeOH, CHCl3-MeOH, CH3CN, PrOH, Aceton, Éter EtOH (Cohn-féle frakcionálás), hődenaturáció (NH4)2SO4, Na2SO4, PEG, kaprilsav, Rivanol, stb. Triklór ecetsav, perklórsav, foszforwolframsav, szulfoszalicilsav,

23 SOXHLET KÉSZÜLÉK ELLENÁRAMÚ EXTRAKCIÓ

24 SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)
MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)

25

26 SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ
MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) AZ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA (TÖLTET, CARTRIDGE) A MINTA KÖLCSÖNHATÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL ? („C” - SiO2 - Al2O3 – CN – OH – NH – IEX – RP 2-18 – HIC – SEC – AFF ) RETENCIÓS ADATOK (HPLC)? SZELEKTIVITÁS AZ ÁLLÓ FÁZISRA? ÁLLÓ FÁZIS HIDRODINAMIKAI JELLEMZŐI (SZEMCSE MÉRET, ELOSZLÁS, ALAK, TÖLTÉS MINŐSÉGE) TÖLTET REPRODUKÁLHATÓSÁGA (BATCH TO BATCH)

27 SZERVES MINTA (MW<2000Da)
OLDÓDIK SZERVES OLDÓSZERBEN VÍZBEN / | \ / \ POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS IONOS NEM IONOS (ION-PÁR) MeOH Hexán KATIONOS ANIONOS POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS CH3CN Heptán EtAc CHCl3 NPC ADS RPC IEX NPC ADS RPC CIANO KIESELGUHR C CIANO AMINO CIANO SíOH C18 KIESELGEL DIOL SiOH C COOH NH2/NH DIOL FLORISIL C8 AMINO FLORISIL CIKLO SO3H NR NH2/NH Al2O CIKLO HEXIL HEXIL -NH2/NH Al2O FENIL - CN FENIL - CN

28 SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ
MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) AZ ÁRAMLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA (MINTA OLDÓSZERE, MOSÓFOLYADÉK, ELUENS) A MINTA ÖSSZETEVŐINEK OLDÉKONYSÁGA KÖLCSÖNHATÁSOK LÉTREHOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL ÉS/VAGY MEGBONTÁSA DIFFERENCIÁLÁS LEHETŐSÉGE (OLDÓSZER ELEGYEK)

29 SZERVES MINTA (MW>2000Da)
OLDÓDIK SZERVES OLDÓSZERBEN VÍZBEN / \ IONOS NEM-IONOS / \ Ion-pár képző KATIONOS ANIONOS RPC WP-BUTIL (C4) IEX SEC IEX WP-BUTIL (C4) SEC WP-COOH WP-PEI Sephadex G Sephadex G-25 HEXÁN HEXÁN PUFFER METILÉN KLORID VIZES PUFFEREK METILÉN KLORID ACETONITRIL ACETONITRIL ACETON ACETON METANOL – VIZ METANOL - VIZ

30 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ
(Solid Phase Extraction, SPE, SPME) A SPE ALKALMAZHATÓSÁGÁNAK ÁLTALÁNOS SZABÁLYA AZ ÁLLÓ FÁZIS ERŐSEN POLÁRIS GYENGÉN POLÁRIS-APOLÁRIS SiO C18 A MINTA OLDÓSZERE GYENGÉN POLÁRIS ERŐSEN POLÁRIS (MOSÓFOLYADÉK) (HEXÁN, THF) (H2O, AcOH, TFA) AZ ELUÁLÓ ERŐSEN POLÁRIS APOLÁRIS OLDÓSZER (VIZES PUFFER, AcOH, MeOH) (MeOH, ACN) A MINTA ELŐSZÖR A ÖSSZETEVŐINEK LEGAPOLÁRISABB LEGPOLÁRISABB LEOLDÓDÁSI ÖSSZETEVŐK SORRENDJE OLDÓDNAK LE

31 Minta előkészítés Extrelut NT-vel
3. Szerves oldószer felvitele (vízzel nem elegyedő) 2. Vizes alapú minta felvitele 4. Elúció Lipofil komponensek kinyerése a mintából

32 LiChrospher® ADS Alkyl Diol Silica
LC-integrált (on-line) mintaelőkészítéshez Kettős módosítással készült szilika részecskék (25 µm): Hidrofil külső felület DIOL módosítással biokompatibilis diol borítás elkerülhető a proteinek/nukleinsavak irreverzibilis adszorpciója a szilika részecskék felületén nincs oszlop eltömődés nem növekszik a nyomás Hidrofób belső felület: pórusfalak fordított fázisú módosítással (RP- 4, RP- 8 ill. RP-18) a retenciós tulajdonságok az analit polaritásához igazíthatók a pórusok csak kis méretű analitok számára hozzáférhetők (MW < 15,000 Dalton) nagyobb makromolekulák (pl. proteinek, nukleinsavak) a pórusokon kívül maradnak és kvantitatívan eltávolíthatók

33 Makromolekuláris összetevők
(protein, nukleinsav) Diol felületi réteg Kismolekulájú apoláris összetevők Apoláris belső szerkezet LiChrospher  ADS

34 Többrétegű héjszerkezetű kromatográfiás
állófázis (C18) vázlatos szerkezete és pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

35 SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER ELŐZETES VIZSGÁLATA
MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER ELŐZETES VIZSGÁLATA SORÁN MEG KELL HATÁROZNI AZ EXTRAKCIÓ OPTIMÁLIS MÓDJÁT, A MÁTRIX MÓDOSÍTÁSÁNAK LEHETŐSÉGÉT, A MEGFELELŐNEK TARTOTT ÁLLÓ FÁZIST (TÖLTET, SZORBENS), A MEGFELELŐNEK TARTOTT OLDÓSZERELEGYEKET (MOSÓ-ELUÁLÓ), A MINTA (MINIMÁLIS-SZÜKSÉGES) TÉRFOGATÁT, AZ ÁLLÓ FÁZIS MÉRETÉT (ÁTTÖRÉSI TÉRFOGAT-MENNYISÉG)

36 SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER OPTIMÁLÁSA
MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER OPTIMÁLÁSA REPRODUKÁLHATÓSÁG, VISSZANYERÉS REFERENCIA VEGYÜLETEKKEL, HATÁSOSSÁG MATRIX NÉLKÜL ÉS KOMPLEX (BIOLÓGIAI) RENDSZERBEN, INTERFERÁLÓ ANYAGOK HATÁSÁNAK MODELLEZÉSE, VALIDÁLÁS BELSŐ ÉS KÜLSŐ STANDARDOKKAL (ROBOSZTUSSÁG) HIBA, SZÓRÁS, ÉRZÉKENYSÉG, KIMUTATHATÓSÁGI HATÁR, SPECIFICITÁS MEGHATÁROZÁSA, KÖLTSÉGKIHATÁS, GAZDASÁGOSSÁG BECSLÉSE.

37 A FOLCH-FÉLE EXTRAKCIÓ Apoláris (lipidek-zsírok) vegyületekre
VIZES FÁZISÚ MINTA TÉRFOGAT (VÉRSZÉRUM, SZÖVET HOMOGENIZÁTUM) KLOROFORM-METANOL (1:1) FORRÁSIG HEVÍTÉS KLOROFORM SZŰRÉS – CENTRIFUGÁLÁS VÁLASZTÓTÖLCSÉRBEN 1% KCl 0,2 TÉRFOGAT ELVÁLASZTÁS KLOROFORM (ALSÓ) FÁZIS BEPÁRLÁSA ANALIZIS (TLC, HPLC) VIZES MeOH CHCl3

38 POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK (ZSÍROK) TLC ANALIZISE EGYDIMENZIÓS KÉT LÉPÉSES ELVÁLASZTÁS LÉPÉSBEN: CHCl3-MeOH-AcOH ( ) LÉPÉSBEN: HEXÁN-ÉTER-AcOH ( ) ELŐHIVÁS: PMS

39 HPLC MINTAELŐKÉSZÍTÉS – SPE
TERMÉSZETES POLI (OLIGO) AMINOK MEGHATÁROZÁSA Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok Homogenizálás foszfát pufferben, pH 7,2 Kicsapás 7% -os HCIO4 Centrifugálás → felülúszó Tisztítás és előfrakcionálás DOWEX 50X-8 Danzilezés ( 60’ - 540C) Aceton elpárologtatása Extrakció toluollal Szárazra párlás, Oldás metanolban HPLC

40 A t-RNS SZERKEZETE PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN

41 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS – SPE
NUKLEOZIDOK (Ade, Cyt, Gua, Uri, Ψ-Uri) ELVÁLASZTÁSA BORONÁT AFFINITÁSI FÁZISON NH4Ac puffer pH:8,8 0,1M HCOOH HPLC

42 ▼ ▼ ▼ MINTAELŐKÉSZÍTÉS - SPE NEM ELEGYEDŐ FÁZISÚ OLDÓSZERES EXTRAKCIÓ
HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) IZOLÁLÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HUMÁN SZÉRUM ▼ NEM ELEGYEDŐ FÁZISÚ OLDÓSZERES EXTRAKCIÓ KLOROFORM-METANOL-VÍZ CENTRIFUGÁLÁS ▼ VIZES-METANOLOS FÁZISBÓL FEHÉRJÉK KICSAPÁSA ETANOLLAL CENTRIFUGÁLÁS ▼ FESTÉK-LIGAND (Cibacron Blue) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

43

44

45