Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I. MINTAELŐKÉSZÍTÉS ELMÉLETE, MŰVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I. MINTAELŐKÉSZÍTÉS ELMÉLETE, MŰVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest."— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I. MINTAELŐKÉSZÍTÉS ELMÉLETE, MŰVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2 KÉMIAI TUDOMÁNYOK SZERVETLEN – SZERVES KLASSZIKUS SZERVETLEN ÉS SZERVES ANALITIKAI KÉMIA BIOLÓGIA – BIOMOLEKULÁRIS KÉMIA BIOANALITIKA ELVÁLASZTÁSTECHNIKÁK ELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY

3 Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN PROTEOME (Wasinger et al. 1995) „protein equivalent of a genom” „protein complement encoded by a given genom” PROTEOMICS - GENOMICS

4 PROTEOMICS (Wang és Hanasch, 2003) EXPRESSION PROTEOMICS A genomban kódolt valamennyi fehérje azonosítása és mérése, Celluláris lokalizációjuk és poszt-transzlációs módosításuk meghatározása. FUNCTIONAL PROTEOMICS A FEHÉRJÉK KÖLCSÖNHATÁSAINAK VIZSGÁLATA AZ INDIVIDUÁLIS FEHÉRJÉK SZEREPÉNEK MEGHATÁROZÁSA A SPECIFIKUS ANYAGCSERE FOLYAMATOKBAN ÉS CELLULÁRIS STRUKTÚRÁKBAN A FEHÉRJÉK SZERKEZETÉNEK ÉS FUNKCIÓJÁNAK FELDERÍTÉSE

5 FUNKCIONÁLIS PROTEOMIKA BIOMOLEKULÁRIS KÉMIA BIOPOLIMEREK MOLEKULA SZERKEZETÉNEK KUTATÁSA ANOMÁLIS MOLEKULASZERKEZETEK KIMUTATÁSA A FEHÉRJÉK POSZTTRANSZLÁCIÓS FOLYAMATAINAK ÉS MECHANIZMUSAINAK VIZSGÁLATA (GLIKOZILÁLÁS) GYAKORLATI CÉLOK – ALKALMAZOTT KUTATÁS DIAGNOSZTIKA - PROGNOSZTIKA - MARKEREK (PL. DAGANATOS MEGBETEGEDÉSEK FELISMERÉSE)

6 ELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY ELVÁLASZTÁSI FELADATOK MINTA ELŐKÉSZITÉS ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK EGYIDEJÜ ÉS ÖSSZEHANGOLT ALKALMAZÁS MULTIMODÁLIS – MULTIDIMENZIONÁLIS ANALITIKAI – PREPARATIV

7

8 AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI RENDSZER

9 ANALITICA EST ANCILLA CHEMIAE ? Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN

10 MINTA ELŐKÉSZITÉS ÁLTALÁNOS SZEMPONTOK ÉS KÖVETELMÉNYEK A MINTA JELLEMZÉSE A VIZSGÁLANDÓ VEGYÜLET(EK) TULAJDONSÁGAINAK ISMERETE MOLEKULATÖMEG, ALAK, MINŐSÉG (Globuláris-fibrilláris, aggregáció, flexibilitás, belső viszkozitás), SZERKEZET, FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK, OLDÉKONYSÁG, SZOLVATÁCIÓ-HIDRATÁCIÓ, POLARITÁS, pK A, pK I HIDRODINAMIKAI JELLEMZŐK (Diffúziós állandó, Stokes-rádiusz), SPEKTROSZKÓPIAI ADATOK, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS (Enzimatikus, élettani, stb.) STABILITÁS (Fény, Hő, Idő) ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK (pI) IRODALMI ADATOK HASONLÓ SZERKEZETÜ ANYAGOKRA (ADATBÁZIS)

11 MINTA ELŐKÉSZITÉS A BIOLÓGIAI KÖRNYEZET (MATRIX) JELLEGE Kinyerhető-e a vizsgálandó anyag a változatlan mátrixból, Felszabadítható-e a szilárd fázisból, Csökkenthető-e a mátrix kötésének erőssége, (pl. higítás, pH, ionerősség, stb. változtatásával) Vannak-e jelen potenciális interferáló vegyületek. AZ INTERFERÁLÓ ANYAGOK VIZSGÁLATA A minta jellemzéséhez hasonlóan.

12 MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZÍTÉS IGÉNYEI CLEAN UP - SELECTIVE ENRICHMENT TISZTITÁS IGÉNYE felmerül-e ? (Specifikus detektálhatóság, interferáló anyagok?) TÖMÉNYITÉS IGÉNYE felmerül-e ? (Oldékonyság, detektálhatóság, ?) OLDÓSZER CSERE (váltás) igénye felmerül-e ? - Alkalmas-e az eluáló oldószer(elegy) a HPLC-re ? - Alkalmas-e a vizes elúció a detektálásnál ? - Szükséges-e más (illékony) oldószer alkalmazása ?

13

14 MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZITÉS MÜVELETEI FIZIKAI-MECHANIKAI MÜVELETEK MINTAVÉTEL (Random, statisztikai, anatómiai heterogenitás, stb.) APRITÁS, ÖRLÉS, HOMOGENIZÁLÁS (Késes, Grinder, Potter, Dounce, Ultrahang) SZITÁLÁS, SZÜRÉS, ULTRASZÜRÉS, DIALIZIS CENTRIFUGÁLÁS - ULTRACENTRIFUGÁLÁS KIVONÁS (EXTRAKCIÓ), TÖMÉNYITÉS, SZÁRITÁS

15

16

17 MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZITÉS MÜVELETEI KÉMIAI MÜVELETEK HIGITÁS, IONERŐSSÉG, pH VÁLTOZTATÁS HIDROLIZIS (Savas, lúgos, enzimatikus) SZÁRMAZÉK KÉPZÉS (Kromofor csoportok, polaritás változtatás, stb.) ADALÉKANYAGOK (Ion-pár képzés, detergensek, polaritás változtatás) SPECIÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK (Immuno-affinitás, zárvány-fém komplex)

18 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN Elektroforézis - Elektromigráció ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK GRAVITÁCIÓS ERŐTÉRBEN Centrifugálás – Ultracentrifugálás

19 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK SZITÁLÁS, SZŰRÉS, ULTRA(MOLEKULA)SZŰRÉS, DIALIZIS SZÁRÍTÁS (BEPÁRLÁS, VÁKUUM BEPÁRLÁS, FAGYASZTVA SZÁRÍTÁS) SZÉTKRISTÁLYOSÍTÁS (pl. diasztereomer sópárok) KIVONÁS – EXTRAKCIÓ GÁZ-GŐZ FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Vákuum, vagy vízgőz desztilláció, Gőztér (head space) analizis, Vivőgázzal (N 2 Ar, He), Kriocsapdával (purge and trap) FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ SZUPERKRITIKUS ÁLLAPOTÚ (CO 2, CS 2 ) EXTRAKCIÓ

20 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS KIVONÁS – EXTRAKCIÓ FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Megoszlási egyensúly létrehozása nem elegyedő oldószer (vizes!) fázisok között Szakaszos (pl. kirázás választótölcsérben), Folyamatos (ellenáramú, counter current) technikák FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Oldószeres, sós, savas kicsapás (precipitáció) Szilárd fázisból történő extrakció Soxhlet eljárás, Szilárd fázison történő extrakció SPE (Solid Phase Extraction)

21 AZ FOLYAMATOS ELLENÁRAMÚ FOLYADÉK- FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Countercurrent Flow-Through Coil Centrifuge (Ito et al. 1971)

22 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ OLDÓSZERES, SÓS, SAVAS KICSAPÁS (PRECIPITÁCIÓ – BIOLÓGIAI MINTÁK) MeOH, CHCl 3 -MeOH, CH 3 CN, PrOH, Aceton, Éter EtOH (Cohn-féle frakcionálás), hődenaturáció (NH 4 ) 2 SO 4, Na 2 SO 4, PEG, kaprilsav, Rivanol, stb. Triklór ecetsav, perklórsav, foszforwolframsav, szulfoszalicilsav,

23 SOXHLET KÉSZÜLÉK ELLENÁRAMÚ EXTRAKCIÓ

24 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)

25

26 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) AZ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA (TÖLTET, CARTRIDGE) A MINTA KÖLCSÖNHATÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL ? („C” - SiO 2 - Al 2 O 3 – CN – OH – NH – IEX – RP 2-18 – HIC – SEC – AFF ) RETENCIÓS ADATOK (HPLC)? SZELEKTIVITÁS AZ ÁLLÓ FÁZISRA? ÁLLÓ FÁZIS HIDRODINAMIKAI JELLEMZŐI (SZEMCSE MÉRET, ELOSZLÁS, ALAK, TÖLTÉS MINŐSÉGE) TÖLTET REPRODUKÁLHATÓSÁGA (BATCH TO BATCH)

27 SZERVES MINTA (MW<2000Da) OLDÓDIK SZERVES OLDÓSZERBEN VÍZBEN / | \ / \ POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS IONOS NEM IONOS (ION-PÁR) MeOH Hexán KATIONOS ANIONOS POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS CH 3 CN Heptán EtAc CHCl 3 NPC ADS RPC IEX NPC ADS RPC CIANO KIESELGUHR C18 CIANO AMINO CIANO SíOH C18 KIESELGEL DIOL SiOH C8 -COOH NH 2 /NH DIOL FLORISIL C8 AMINO FLORISIL CIKLO -SO 3 H -NR 3 + -NH 2 /NH Al 2 O 3 CIKLO HEXIL HEXIL -NH 2 /NH Al 2 O 3 FENIL - CN FENIL - CN

28 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) AZ ÁRAMLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA (MINTA OLDÓSZERE, MOSÓFOLYADÉK, ELUENS) A MINTA ÖSSZETEVŐINEK OLDÉKONYSÁGA KÖLCSÖNHATÁSOK LÉTREHOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL ÉS/VAGY MEGBONTÁSA DIFFERENCIÁLÁS LEHETŐSÉGE (OLDÓSZER ELEGYEK)

29 SZERVES MINTA (MW>2000Da) OLDÓDIK SZERVES OLDÓSZERBEN VÍZBEN / \ IONOS NEM-IONOS / \ Ion-pár képző KATIONOS ANIONOS RPC WP-BUTIL (C4) IEX SEC IEX WP-BUTIL (C4) SEC WP-COOH WP-PEI Sephadex G-25 Sephadex G-25 HEXÁN HEXÁN PUFFER METILÉN KLORID VIZES PUFFEREK METILÉN KLORID ACETONITRIL ACETONITRIL ACETON ACETON METANOL – VIZ METANOL - VIZ

30 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) A SPE ALKALMAZHATÓSÁGÁNAK ÁLTALÁNOS SZABÁLYA AZ ÁLLÓ FÁZIS ERŐSEN POLÁRIS GYENGÉN POLÁRIS-APOLÁRIS SiO 2 C18 A MINTA OLDÓSZERE GYENGÉN POLÁRIS ERŐSEN POLÁRIS (MOSÓFOLYADÉK) (HEXÁN, THF) (H 2 O, AcOH, TFA) AZ ELUÁLÓ ERŐSEN POLÁRIS APOLÁRIS OLDÓSZER (VIZES PUFFER, AcOH, MeOH) (MeOH, ACN) A MINTA ELŐSZÖR A ÖSSZETEVŐINEK LEGAPOLÁRISABB LEGPOLÁRISABB LEOLDÓDÁSI ÖSSZETEVŐK SORRENDJE OLDÓDNAK LE

31 Minta előkészítés Extrelut NT-vel 4. Elúció Lipofil komponensek kinyerése a mintából 3. Szerves oldószer felvitele (vízzel nem elegyedő) 2. Vizes alapú minta felvitele 1. Extrelut® NT

32 Kettős módosítással készült szilika részecskék (25 µm): Hidrofil külső felület DIOL módosítással  biokompatibilis diol borítás  elkerülhető a proteinek/nukleinsavak irreverzibilis adszorpciója a szilika részecskék felületén  nincs oszlop eltömődés  nem növekszik a nyomás Hidrofób belső felület: pórusfalak fordított fázisú módosítással (RP- 4, RP- 8 ill. RP-18)  a retenciós tulajdonságok az analit polaritásához igazíthatók  a pórusok csak kis méretű analitok számára hozzáférhetők (MW < 15,000 Dalton)  nagyobb makromolekulák (pl. proteinek, nukleinsavak) a pórusokon kívül maradnak és kvantitatívan eltávolíthatók LiChrospher® ADS Alkyl Diol Silica LC-integrált (on-line) mintaelőkészítéshez

33 Kismolekulájú apoláris összetevők Makromolekuláris összetevők (protein, nukleinsav) LiChrospher  ADS Diol felületi réteg Apoláris belső szerkezet

34 Többrétegű héjszerkezetű kromatográfiás állófázis (C18) vázlatos szerkezete és pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

35 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER ELŐZETES VIZSGÁLATA SORÁN MEG KELL HATÁROZNI AZ EXTRAKCIÓ OPTIMÁLIS MÓDJÁT, A MÁTRIX MÓDOSÍTÁSÁNAK LEHETŐSÉGÉT, A MEGFELELŐNEK TARTOTT ÁLLÓ FÁZIST (TÖLTET, SZORBENS), A MEGFELELŐNEK TARTOTT OLDÓSZERELEGYEKET (MOSÓ-ELUÁLÓ), A MINTA (MINIMÁLIS-SZÜKSÉGES) TÉRFOGATÁT, AZ ÁLLÓ FÁZIS MÉRETÉT (ÁTTÖRÉSI TÉRFOGAT-MENNYISÉG)

36 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER OPTIMÁLÁSA REPRODUKÁLHATÓSÁG, VISSZANYERÉS REFERENCIA VEGYÜLETEKKEL, HATÁSOSSÁG MATRIX NÉLKÜL ÉS KOMPLEX (BIOLÓGIAI) RENDSZERBEN, INTERFERÁLÓ ANYAGOK HATÁSÁNAK MODELLEZÉSE, VALIDÁLÁS BELSŐ ÉS KÜLSŐ STANDARDOKKAL (ROBOSZTUSSÁG) HIBA, SZÓRÁS, ÉRZÉKENYSÉG, KIMUTATHATÓSÁGI HATÁR, SPECIFICITÁS MEGHATÁROZÁSA, KÖLTSÉGKIHATÁS, GAZDASÁGOSSÁG BECSLÉSE.

37 VIZES MeOH A FOLCH-FÉLE EXTRAKCIÓ Apoláris (lipidek-zsírok) vegyületekre VIZES FÁZISÚ MINTA 1 TÉRFOGAT (VÉRSZÉRUM, SZÖVET HOMOGENIZÁTUM) KLOROFORM-METANOL (1:1) 16 FORRÁSIG HEVÍTÉS KLOROFORM 8 SZŰRÉS – CENTRIFUGÁLÁS VÁLASZTÓTÖLCSÉRBEN 1% KCl 0,2 TÉRFOGAT ELVÁLASZTÁS KLOROFORM (ALSÓ) FÁZIS BEPÁRLÁSA ANALIZIS (TLC, HPLC) CHCl 3

38 POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK (ZSÍROK) TLC ANALIZISE EGYDIMENZIÓS KÉT LÉPÉSES ELVÁLASZTÁS 1. - LÉPÉSBEN: CHCl 3 -MeOH-AcOH ( ) 2. - LÉPÉSBEN: HEXÁN-ÉTER-AcOH ( ) ELŐHIVÁS: PMS

39 Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok Homogenizálás foszfát pufferben, pH 7,2 Kicsapás 7% -os HCIO 4 Centrifugálás → felülúszó Tisztítás és előfrakcionálás DOWEX 50X-8 Danzilezés ( 60’ C) Aceton elpárologtatása Extrakció toluollal Szárazra párlás, Oldás metanolban MINTAELŐKÉSZÍTÉS – SPE TERMÉSZETES POLI (OLIGO) AMINOK MEGHATÁROZÁSA HPLC

40 PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN A t-RNS SZERKEZETE

41 MINTA ELŐKÉSZÍTÉS – SPE NUKLEOZIDOK (Ade, Cyt, Gua, Uri, Ψ-Uri) ELVÁLASZTÁSA BORONÁT AFFINITÁSI FÁZISON 0,1M HCOOH HPLC NH 4 Ac puffer pH:8,8

42 HUMÁN SZÉRUM NEM ELEGYEDŐ FÁZISÚ OLDÓSZERES EXTRAKCIÓ KLOROFORM-METANOL-VÍZ CENTRIFUGÁLÁS FESTÉK-LIGAND (Cibacron Blue) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) IZOLÁLÁSA ÉS TISZTÍTÁSA ▼ ▼ VIZES-METANOLOS FÁZISBÓL FEHÉRJÉK KICSAPÁSA ETANOLLAL CENTRIFUGÁLÁS ▼ MINTAELŐKÉSZÍTÉS - SPE

43

44

45


Letölteni ppt "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I. MINTAELŐKÉSZÍTÉS ELMÉLETE, MŰVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest."

Hasonló előadás


Google Hirdetések