Transzglikozilálás v. transzglikozilezés

Az előadások a következő témára: "Transzglikozilálás v. transzglikozilezés"— Előadás másolata:

1 Transzglikozilálás v. transzglikozilezés
Termék lehet: glikozid, di-, tri- ... poliszaharid. Akceptor: alkohol, mono-, di-...poliszaharid. melléktermék Glikozil donor : Aktiválthexóz:UDP-,GDP-glükóz hexóz-foszfát, di-, tri-... Poliszaharid (és aktivált…) Helyettesítettek is! Hexózamin, metilszármazékok…… Pseudomonas glükóz P + fruktóz szaharóz + Pi Glikoziltranszferázok 2.4.1.x : hexoziltranszferázok 2.4.2.x: pentoziltranszferázok

2 glükóz(1 6) glükóz(1 4) glükóz + glükóz
OH CH H HO O CH2OH HOCH CH2 Aspergillus niger maltóz+maltóz glükóz(1 6) glükóz(1 4) glükóz + glükóz glükóz(1 4) glükóz 2 donor akceptor

3 60-as években 6 év: mikrobiológiai transzglikozilálási módszerrel több mint 30 oligoszaharidot ill. származékot szintetizáltak. Ez a szám megközelíti az E.Fischer óta kémiai módszerekkel nyert vegyületek számát.

4 Kapszuláris poliszaharidok: CPS
intracelluláris szintézis sejtfal, tok-,kapszula-nyálka nem jelentősek Extracelluláris poliszaharidok: EPS intracelluláris, vagy sejtmembránon történőszintézis vagy biotranszformációval

5 DEXTRÁN Neu Leuconostoc gl sokcélú
Mikrobiális poliszaharidok: exopoliszaharidok CELLULÓZ Acetobacter gl CURDLÁN Agrobacterium gl gélek,élelmipar DEXTRÁN Neu Leuconostoc gl sokcélú Leván Bacillus, fr (fordított!) Leuconostoc Serratia marcescens PULLULÁN Pullularia pullulans gl 1,4-1,6 stat GLÜKÁN S.cerevisiae gl SCLEROGLÜKÁN Neu Sclerotium glucanicum,,Sclerotium rolfsii gl ALGINÁT Pseudomonas aeruginosa, Macrocystis pyrifera poli-anhidro-β D-mannuronsav (1→ 4) illetve L-guluronsav Azotobacter vinelandii FOSZFOMANNÁN Hansenula capsulata XANTÁN Sav Xantomonas campestris gl glükuronsav!!! Poli-β-hidroxi-butirát Alcaligenes eutrophus(Ralstonia eutropha) PHB illetve PHA-k (valerát, kaproát stb) Transzglikozilálás [ O – CH - CH2 - C ] R O FRUKTÓZ96% SZA PHB

6 lineáris β-(1→4)-glükán Mikrofibrilláris élelmi rostként kurdlán
poliszaharid mikroorganizmus szerkezet felhasználás cellulóz Acetobacter lineáris β-(1→4)-glükán Mikrofibrilláris élelmi rostként kurdlán Agrobacterium Alcaligenes faecalis lineáris β-(1→3)-glükán Gélek, élelmiszeripar pullulán Aureobasidium pullulans, Pullularia pullulans lineáris 2*α-(1→4), α-1*(1→6)-glükán Erős rost- és filmképző (cellofán helyettesítő) szkleroglükán Sclerotium rolfai, Sc. glucanicum β-(1→6) elágazásokkal Festékipar gellán Pseudomonas elodea Lineáris heteropoliszaharid[1] -βD-Gl-(1→4)-βD-GlcA-(1→4)-βD-Gl-(1→4)- - αD-Rha-(1→3)- Agar és karragén helyettesítő, Élelmiszadalék. alginát Macrocystis pyrifera Pseudomonas aeruginosa Azotobacter vinelandii 6*βD-MannA-(1→4)- -6*βD-GlcA-(1→4) Főleg az alga eredetűt használják: enzimrögzítés, élelmiszerek [1] Az első glükóz egységen O-acetil és gliceril csoport is van

7 M ≥ 106 Transzglikozilálás 4 xantán Acetát,pyr
Triszaharid oldallánc:gl,glükuronsav Olajkút Élelmiszer festékek (polielektrolit)

8 M ≥ 106 Bioszintézis: CM-on, UDP-glükóz donor, GDP-mannóz
Xantomonas campestris xantán M ≥ 106 Triszaharid oldallánc (polielektrolit) Olajkút Élelmiszer festékek Bioszintézis: CM-on, UDP-glükóz donor, GDP-mannóz Aktivált donorokkal

9 Calcium poly-a-L-guluronate left-handed helix
Oldalnézet, a H-hidakkal és Ca-mal „előlnézet”, V „alulnézet”

10 DEXTRÁN Transzglikozilálás Heterofermentatív tejsavbakt.
Leuconostoc mesenteroides Dextrán szaharáz EC 1,6 SZAHARÓZ + n SZAHARÓZ DEXTRÁN + n FRUKTÓZ Alkoholos kicsapás fruktóz NB.: NINCS HIDROLÍZIS A TR.GL. ELŐTT!!! Elágazás: branching enzyme Dextranáz enzim: cukoripar,(kül.moltömeg) dextrán gl + oligoszaharidok 1,3 1,4 1,2 Pharmacia: Sephadex Pharmacia →Pfizer 2006

11 Elágazások: branching enzyme 1,3 1,4 1,2 –glikozid kötések
Szaharóz + ((1 6)-α-D-glikozil).(n) n.D-fruktóz + ((1 6)- α-D-glikozil).(n+1) Elágazások: branching enzyme 1,3 1,4 1,2 –glikozid kötések L.mesenteroides dextrán-szaharáz 1 6 n+1 n

12 Un akceptor reakció

13 glikogénből képes CD-t előállítani.
Ciklodextrin A ciklodextrinek nem redukáló, kristályos, vízoldható ciklikus oligoszaharidok: 6,7 v 8 glükóz egységből állnak. Szintézis: CGTase (EC cyclodextrin glucanotransferase): α-1,4 glikozil láncokra hat, azaz keményítőből: amilózból, amilopektinből és glikogénből képes CD-t előállítani. Előbb α-amilázos kezelés.8-10% elfolyósított oldat +CGTase 55oC, 5,8-6,6pH, szakaszos reaktor. Keverék képződik( pl: 22% α, 11% β, 5% γ), elválasztás vízoldhatóság alapján vagy szelektív adszorpcióval. Az enzimet pl. Bacillus circulans-szal állítják elő.

14

15 aromások, alkoholok,halidok, zsírsavak észterek, stb
Belül inkább hidrofób γ-CD β-CD progeszteron OH csoportok kívül Vendég molekulák: aromások, alkoholok,halidok, zsírsavak észterek, stb

16 KONDENZÁCIÓ,ADDÍCIÓ,Csoport eltávolítás (liázok)
1921 80% Szimpatikus Idegizgatószer Asztma, Taxol oldallánc

17 Parkinson-kór: DOPAMIN v. receptorhiány az agyban
(Tyr dezaminálás) Erwinia herbicola sejtszuszpenzióval (EC ) (diOH-Phe) +enziminhibitor! Parkinson-kór: DOPAMIN v. receptorhiány az agyban biogén amin, neurotranszmitter Együtt a gyógyszerek

18 Óriás enzimek: 4-5 alegység, 130000 D 18-20 520000 D
EC monomer koagulátor talajkondícionáló papírgyártás Cu-katalízis Rhodococcus rhodochrous immob. sejtjei fehérbiotech 1984, Mitsubishi Rayon Óriás enzimek: alegység, D D Optimális hőmérséklet 35oC de 10oC-on végzik a reakciót! 100000t/Év Kémiai eljárás Enzimes eljárás Reakció hőmérséklete 70 OC 0-15 OC konverzió 70-80% 99,9% Töményítés a feldolgozásnál szükséges Nem szükséges Energia igény (gőz,elektomos) 1,9 MJ/kg 0,4 MJ/kg CO2 termelés 1,5 kg CO2/ kg 0,3 kg CO2/ kg Nitto:rátáplálásos eljárás 2.106 U/dm3 80 kg/m3h produktivitás 99,9% konverzió Szűrés, színtelenítés

19 Corynebact. glutamicum Brevibacterium flavum sejtekkel
FUMÁRSAV Egyensúlyi keverék: 85% almasav, 15% fumársav, de: 1% oldhatóságú Ca-fumarát a szubsztrát. Ez a szintén 1% oldhatóságú Ca-maláttá alakul , kicsapódik az oldatból egyensúly eltolódik a képződés irányába (Ezt a módszert s l u r r y biokonverziónak nevezik, hasonlít a szteroid pszeudokristály fermentációra). EC L-aszpartát-ammónia liáz ( ) Corynebact. glutamicum Brevibacterium flavum sejtekkel E. coli enzim rögzítve, vagy Brevibacterium flavum rögzített teljes sejt Iparilag is alkalmazott L-aszparaginsav előállítási módszer ( Kyowa Hakko Kogyo) szakaszos és folytonos dugóáramú reaktorban megvalósított folyamatok, konverzió 99% feletti. aszpartám alapanyag

20 Izomerizálás (EC 5.x.x.x) glükóz izomerizációja fruktózzá
Édesség: % % 100% % szaharóz Potenciális enzimek:

21 Izomerizálás 2 As (arzenát) Potenciális enzimek:
Gl-P-izomeráz (EC D-Glucose-6-phosphate-ketol-isomerase) E.intermedia Aerobacter aerogenes Aerobacter cloaceae As (arzenát) Glükóz-izomeráz (EC D-glucose-ketol-isomerase) Heteroferm. tejsavbacik kis hőfokoptimum D-xylóz-izomeráz (EC D-xylose-ketol-isomerase) Előnyök: kis pH opt.(pszikóz) nagy fajlagos aktivitás hőfokoptimum 80oC (nincs koenzim) IPARI Bacillus coagulans (NOVO) Arthrobacter sp. (ZENECA) Actynoplanes missouriensis (GIST-BROCADES) Streptomyces albus (MILES Lab.)

22 Izomerizálás 3

23 Izomerizálás 4 Konverzió szakaszos üzemű és fixágyas töltött oszlop
WHOLE-CELL Gl-izomeráz SWEETZYME 1 kg enz, kg gl. 55-60oC, tenyésztés és sejthomogenizálás(=sejtfeltárás!), a sejteket keresztkötés létesítéssel rögzítik, porlaszva szárítás→ enzim-por, fagyasztva szárítás → enzim-pelyhek extrudált enzim-rudacskák Konverzió szakaszos üzemű és fixágyas töltött oszlop reaktorokban. Mg , Co Ca 1 mg 70% sza.: 42% fr 53% gl 42:51:7 HFS Kromatogr.: akár 90 % fr

24 Zeneca S D D’Sousa: Immobilized enzymes in bioprocesses, Current Science Online 77(1) 69

25 Izomerizálás 4 Magyarországon között Szabadegyházán 4 Milliárd forintos beruházással egy évi tonna kapacitású kukoricafeldolgozó üzem létesült. Komplex kukorica hasznosítás Folyékony cukor t sz.a./év Finom szesz absz. hl/év Kukoricacsíra t/év Glutén t/év Takarmány T/év első folyékony cukor üzem Európában. BIOREFINERY

26 RESZOLVÁLÁS Racém keverék

27 RESZOLVÁLÁS Fermentáció: L Enzimes szintézis:L Jelentősége:AS
Szintetikus eá.: D,L Jelentősége:AS

28 RESZOLVÁLÁS 1. Asszimetrikus szintézis : i-Leu, Lys,Met,Phe,Trp,Val
Peptid kötés!

29 RESZOLVÁLÁS 2.Asszimetrikus hidrolízis Aspergillus v. Penicillium L-As-aciláz-zal acilezés As-aciláz D,L- As D,L-acetil-As L-As + D-acetil-As kristályosítás OH- racemizálás D,L- As (Kromatogr.v Oszeres extr.) Ez volt az első ipari alkalmazása az enzimrögzítésnek ( Chibata 1969). Aminoacilázt rögzítettek DEAE-Sephadex-re ionosan és ezt N-acyl-D, L-aminosav rezolválására használták

30 RESZOLVÁLÁS

31 RESZOLVÁLÁS 3. Speciális módszer glutaminsavra H+

32 Amidázos reszolválás „nemtermészetes aminosavak” előállítására (DSM)
Hibás ábra!!! Pseudomonas putida amidáz EC OH Amidázos reszolválás „nemtermészetes aminosavak” előállítására (DSM) un Stecker technológia)

33 Reszolválás lipáz enzimekkel
Lipáz források: sertés pankreász mikrobák (Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, stb) enzimei. EC Triacylglycerol lipase „Dutch State Mines” A PROPRANOLOL béta-blokkoló DSM eljárása: racém glicidáttá prokirális A kinetikus racemizálási kulcslépés során visszamaradó (R)-észter racemizálható és visszavezethető a reszolválási lépésbe. Ilyen és hasonló lipáz-katalizálta sztereoszelektív észter hidrolízisek tömegét alkalmazzák a gyógyszer-laborok és gyárak optikailag tiszta intermedierek és végtermékek előállítására