Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA A Saccharomyces cerevisiae élesztő: a természetben és alkalmazásai Más élesztők Az élesztő eukarióta: az élesztő.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA A Saccharomyces cerevisiae élesztő: a természetben és alkalmazásai Más élesztők Az élesztő eukarióta: az élesztő."— Előadás másolata:

1 ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA A Saccharomyces cerevisiae élesztő: a természetben és alkalmazásai Más élesztők Az élesztő eukarióta: az élesztő sejt Az élesztő szexuális ciklusa és nemi élete Élesztő genetika: alapok Élesztő genetika: élesztő törzsek keresztezése Élesztő genetika: mutáns készítés Élesztő gének klónozása: vektorok Élesztő gének klónozása komplementációval Élesztő gének deléciója Okos géndeléciók és transzpozon mutagenezis Tovább: gének/fehérjék Az élesztőben vizsgált modell rendszerek Élesztő biotechnológia

2 Élesztő WWW helyek yeast.htmlhttp://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/VL- yeast.html

3 A Saccharomyces cerevisiae élesztő: a természetben és felhasználása Az élesztő gyümülcsökön, virágokban és más cukrot tartalmazó helyeken él Az élesztő igen változatos éghajlati körülményekkel is megbírkózik: –Tűrik fagyponttól ~55°C-ig a hőmérsékletet –12°C-tól 40°C-ig képesek osztódni –pH lehetséges a szaporodásuk –Elviselik a gyakorlatilag teljes kiszáradást (por élesztő) –Az élesztő még képes növekedni és fermentálni 3M-os cukor koncentráción (nagy ozmózis nyomás) –20% alkohol koncentrációt még túlél Saccharomyces cerevisiae más élesztők mellet a borkészítés fő organizmusa (mert fermentációs kapacitása nagy és jól tűri a kis pH-t és a nagy etanol koncentrációt) Saccharomyces cerevisiae (carlsbergensis) a sörélesztő, mert még oxigén jelenlétében is alkohollá fermentálja a cukrokat, a lager élesztő 8°C-on is fermentál Saccharomyces cerevisiae a pékélesztő is, cukrokból gyorsan készít széndioxidot Saccharomyces cerevisiae- vel termeltetnek sok értékes fehérjét, mert rekombináns DNS technikákkal jól kezelhető, elismerten biztonságos és fermentációs technológiája nagyon fejlett. Saccharomyces cerevisiae használható drog screening-re és funkcionális analízisre, mert eukarióta és gyakorlatilag olyan könnyen kezelhető, mint a baktériumok. A Saccharomyces cerevisiae a legfontosasbb eukarióta sejt modell rendszer, mert genetikai és sejtbiológiai vizsgálata hatékony; az eukarióta sejtek sok fontos tulajdonságát élesztőben fedezték fel. Ezért a S. cerevisiae –t olyan kutatásokban használják, amelyek az élő sejt tulajdonságainak megismerését, a funkciókat működtető mechanizmusok felderítését célozzák, továbbá a már meglévő biotechnológiai eljárások javítását, vagy újak elkészítését szolgálják.

4 Néhány fontos élesztő Schizosaccharomyces pombe, a hasadó élesztő, a molekuláris és a sejtbiológia fontos modell organizmusa, néhány fermentációban használják. Kluyveromyces lactis, a tej élesztő; modell organizmus némi biotechnológiai jelentősséggel a laktóz fermentáció miatt Candida albicans, nem jó modell, mert nincs szex-ciklus; de vizsgálják, mert humán patogén Saccharomyces carlsbergensis és Saccharomyces bayanus: a S. cerevisiae közeli rokonai, sör és bor készítésre használják. Pichia stipidis, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrovia lipolytica genetikai vizsgálata kisebb jelentőségű (speciális tulajdonságok, mint pl. a peroxiszóma biogenezise), fehérje termelő gazdák Fonalas gombák, a nemzetségek nagy csoportja, mint genetikai modell organizmus, mint pl. Cryptococcus, Aspergillus, Neurospora...., biotechnológiai jelentőség, humán patogének is. A S. cerevisiae is képes fonalas növekedésre.

5 A Saccharomyces cerevisiae eukarióta Ascomyceta gomba Egysejtű, pszeudohifa képzés képességgel S. cerevisiae sarjadzással osztódik (hiszen: sarjadzó élesztő), míg a Schizosaccharomyces pombe hasadással osztódik (hasadó élesztő) A sarjadzás két nem azonos méretű sejtet eredményez, egy anya (öreg) és egy leány (új) sejtet. Az élesztő nem kortalan; a sejtek öregszenek és az anya sejt osztódás után elpusztul. A sejt az eukariótákra jellemző szerkezetű, különböző organellumokkal: - A sejtfal glukánokat, mannánokat és fehérjéket tartalmaz. –Periplazmatikus tér hidrolítikus enzimekkel –Plazma membrán foszfolipid kettősréteggel és sok különböző fehérjével. –Nukleusz nukleolusszal –Vakuolumok mint tároló és hidrolitikus szervecskék –Szekréciós útvonal endoplazmatikus retikulummal, Golgi apparátus és kiválasztó hólyagocskák. –Peroxiszómák az oxidatív degradációhoz –Mitokondriumok a légzéshez Az élesztő sejt kb. 4-7  m nagy. Az alján látható „szemek” a hasadás utáni sebhelyek.

6 Az élesztők életciklusai Sarjadzó élesztő Hasadó élesztő

7 Az élesztőnek van szexuális élete! Az élesztő sejtek haploidként (1n, minden kromoszómából egy kópia) és diploidként (2n, két kópia minden kromoszómából) is tudnak létezni; a 2n sejtek 1,2-szer nagyobbak. A haploid sejtek a vagy  párosodási típusúak. Két haploid sejt párosodik és zigótát képez;az élesztő nem tud mozogni, ezért egymás felé kell nőniük (shmoos). A diploid zigóta a kapcsolódás helyén kezd osztódni. Nitrogén éheztetésre a diploid sejt meiozison megy át és négy haploid spórát tartalmazó aszkusz képzése közben spórázik. Ezért bár az élesztő egysejtű, különböző sejt típusokat tudunk megkülönböztetni, különböző genetikai programmal: –Haploid MATa és MAT  –Haploid és Diploid (MATa/  ) –Spóra –Anyák és lányok

8 Élesztő szex! A szexuális kommunikáció központjában a feromon válasz szignál transzdukciós útvonal van. Ez egy komplex felépítésű útvonal, ami az a- vagy az alfa-faktorra adott választ szabályozza az élesztő sejtekben. Ennek az útvonalnak minden eleme, az élesztőtől az emberig, konzerválódott. Az útvonalban van az a- vagy alfa-faktort kötő receptor (a G-fehérjével kapcsolt hét-transzmembrán receptorok osztályába tartozik, mint sok humán hormon receptor). A feromon kötődése a sejthez a sejtet a feromon forrása, a párosodási partner felé irányítja. A feromon kötődése stimulál egy jelátvivő kaszkádot, az úgynevezett MAP (Mitogen Activated Protein) kináz útvonalat (sok emberi, állati és növényi útvonalhoz hasonlóan). A jelátvivő útvonal megállítja a sejtciklust, hogy a sejtek felkészülhessenek a párosodásra (a sejteknek szinkronban, a G1 fázisban kell lenni a fúzióhoz). Az útvonal a párosodásban fontos gének megnyilvánulását szabályozza.

9 Élesztő szex! Aktus közben: sejt-sejt kapcsolódás, sejt fúzió és sejtmag fúzió elektron mikroszkópi képe. A haploid sejtek párosodási feromon peptideket készítenek: a- illetve alfa- faktort, amire a párosodási partner válaszként felkészül a párosodásra. Ez azt jelenti, hogy az eltérő nemű élesztő sejtek genetikailag megkülönböztethetőek, hiszen eltérő gének készlete nyilvánul meg bennük. Vagyis, olyan haploid specifikus gének, amelyek részt vesznek a feromonra adott válaszban, továbbá az RME1 gén, ez a meiózis represszorát kódolja. Az a-specifikus gének, amelyek az a- faktor termeléséhez kellenek és az alfa- faktor receptor génje. Az alfa-faktor termeléshez szükséges és az a-faktor receptor gének.

10 Az élesztő sejt típusának genetikai meghatározottsága A párosodási típust a III-as kromoszóma MAT lokuszán lévő allél határozza meg. A párosodási típus lokusz szabályozó fehérjéket kódol, azaz transzkripciós faktorokat. A MATa lokusz kódolja az a1 transzkripciós aktivátort (az a2 funkciója nem ismert). A MATalpha lokusz kódolja az alfa1 aktivátort és az alfa2 represszort. A párosodási típus lokusz mester szabályozó lokuszként működik: sok gén megnyilvánulását szabályozza.

11 A párosodási típust meghatározó gének expressziója Az alfa sejtekben az alfa1 aktívátor stimulálja az alfa-specifikus géneket és az alfa2 represszor gátolja az a-specifikus géneket. Az a sejtekben nem aktíválódnak az alfa- specifikus gének és nem represszálódnak az a- specifikus gének, más, eltérő transzkripciós aktívátort használnak a megnyilvánuláshoz. A diploid sejtekben az a1/alfa2 heteromer represszor gátolja alfa1 megnyilvánulását és ezért az alfa-specifikus gének csendesek. Az a- és a haploid-specifikus gének szintén represszáltak. Ilyen haploid-specifikus gén a meiózis represszorát kódoló RME és bár a diploidokban nem nyilvánul meg; a meiózis és a spórázás programok csak tápanyag limitációra kezdődnek el. Összegezve, a sejt típust nagyon kevés primer transzkripciós faktor határozza meg, amelyek egyénileg, vagy pedig kombinációban hatnak. Ez sarkalatos alapelv és a soksejtű organizmusokban is konzerválódott a különböző sejttípusok meghatározásánál: pl. homeotikus gének ( és valóban, az a1 homeobox faktor)

12 A természetben az élesztő sejtek mindig diploidként növekednek, valószínűleg azért, mert javítja túlélési esélyeiket, ha esszenciális génjükben lesz mutáció (mindig van egy másik példány). Nitrogén éheztetésre a diploid sejt spórázik és később a haploid spóra kicsírázik, már ha minden nélkülözhetetlen génje működőképes. Ez gyakran azt jelenti, hogy jó ha egy tetrádból egy spóra életképes. Hogyan lehetünk biztosak, hogy ez az egyetlen spóra talál magának párosodási partnert, hogy újra diploidot képezzenek? A válasz a párosodási típus váltás (mating type switch)! Az első osztódás után az anya-sejt típust vált és párosodik a leányával, hogy diploidot képezzenek, ami persze homozigóta az összes génjére és a sejtek új klónját jelentik. Ha a párosodási típus váltható és a diploid a kedveltebb forma, akkor mi szükség van spórázásra és párosodási típus váltásra? Lehet rá néhány ok: (1) A spórák sokmindent túlélnek (2) A spórázás egy lehetséges módja annak, hogy megszabaduljon a felhalmozódott mutációktól. (3) A meiózis alkalom az allélok új kombinációjának kialakítására, ami előnyösebb lehet, mint a korábbi (4) Néha a sejtek egy másik tetrádból találnak maguknak párt és képeznek egy új klónt, amelyiknek előnyösebb lehet az allél kombinációja Azért, hogy az élesztővel genetikai vizsgálatokat lehessen végezni és, hogy haploid sejteket lehessen szaporítani a laborban, a párosodási típus váltást meg kell előzni: ezért az összes laboratóriumi törzs HO mutáns és nem tud váltani. Hogyan is működik ez a szex váltó? Haploidok és diploidok a természetben és a laborban

13 A haploidok képesek párosodási típust váltani! A párosodási típus váltást két csendes, ugyanazon a kromoszómán lévő párosodási típus lokusz okozza, amelyek akkor válnak aktívvá, ha áthelyeződnek (transzlokálódnak) a MAT lokuszba A MAT lokusz ezen két kópiájának csendesítését részletesen vizsgálták és vannak a magasabb rendűek sejtjeiben is konzerválodott tulajdonságok: heterokromatin képzés. A transzlokáció egy a HO nukleáz által kezdeményezett génkonverzió, ez úgy vág mint egy restrikciós enzim a a kromoszómán lévő párosodási típus lokusz közepébe A laboratóriumi élesztő törzsekből hiányzik a HO nukleáz, ezért stabilan haploid fázisban vannak  Érdekes, hogy csak az anya sejt tud váltani  Ez biztosítja, hogy osztódás után ellentétes típusok legyenek  Ez a szabályozó fehérjék egyenlőtlen öröklődése miatt van  Ez a stratégia konzerválódott és a soksejtű organizmusokban a sejtek differenciálódását okozza (anyai hatás)

14 Élesztő genetika: az örökítő anyag A S. cerevisiae sejtmag genomja 16 kromoszómát tartalmaz Ezen kívül, még van mitokondrium genom és egy plasztid, a 2micron- os plazmid Az élesztő kromoszómáknak van centromerje és telomerje, amelyek egyszerűbbek, mint a magasabb rendű eukariótáké A haploid élesztő genom körülbelül kbp és 1996-ra teljesen szekvenálták ( ez volt az első eukarióta genom szekvencia)

15 Élesztő genetika: az örökítő anyag Az élesztő genom a predikció szerint körülbelül gént tartalmaz, annotációjuk még folyamatban van Számottevő a redundancia, ami egy ősi genom duplikáció következménye Ez azt jelenti, hogy számos génnek van nagyon közeli homológja, amelyek viszont gyakran másként szabályozódnak A legextrémebb példa a cukor transzporter géneké, ezekből több mint húsz van A géneknek durván 1/3-át jellemezték genetikai analízissel, 1/3-uk biokémiai funkciója homológia alapján becsülhető, a maradék harmad nem homológ más génekkel, vagy csak eddig még nem jellemzett génekhez hasonlít Az élesztő géneknek csak kis hányada tartalmaz intront, nagyon kevésben van egynél több; az intronok térképezése még nincs készen A gének közötti intergénes szekvenciák csak 200 és 1000 bp között vannak (intergenic space) A legnagyobb ismert regulátor szekvenciák több mint 2800 bp-ra terjednek ki (MUC1/FLO11)

16 Élesztő genom analízise Az élesztőt kutató társaságok közös célja: minden egyes gén funkciójának meghatározása Ezért néhány nagy program, különböző megközelítési módokkal működik Micro array analízis: a megnyilvánuló gének szimultán meghatározására Micro array analízis minden transzkripciós faktor kötőhelyének meghatározására a genomon Élesztő deléciós analízis: a teljes készlet, több mint 6000 deléciós mutáns van készen Különböző megközelítésekkel vizsgálják ezeket a mutánsokat Minden élesztő gént jelöltek a zölden fluoreszkáló fehérjével (GFP), ami lehetővé teszi a fehérje lokalizációjának megállapítását mikroszkópos vizsgálatokkal Különböző globális fehérje kölcsönhatási vizsgálatok vannak folyamatban

17 Élesztő genetika: nomenklatúra Az élesztő gének neve három betűből és legfeljebb három számból áll: GPD1, HSP12, PDC6...Általában elegendő (vagy nem) rövidítések A vad típusú géneket nagy, dőlt betűkkel írjuk: TPS1, RHO1, CDC28... A recesszív mutáns géneket kis dőlt betűkkel: tps1, rho1, cdc28 A mutáns alléleket kötőjel meg egy számmal: tps1-1, rho1-23, cdc28-2 Ha a mutáció konstruált, pl. gén delécióval, akkor azt is jelöljük, meg a delécióhoz használt genetikai markert is : tps1  ::HIS3 A gén termékét, a fehérjét nagy kezdőbetűvel írjuk és álló betűkkel; gyakran egy „p” betűt teszünk a végére:Tps1p, Rho1p, Cdc28p Sok gént csak szisztematikus szekvenálással találtak meg és amíg funkciójukat meg nem határozzák, addig csak a helyzetükből adódó nevük van: YDR518C, YML016W..., ahol –Y a ”yeast”-ből jön –A második betű a kromoszómát jelöli (D=IV, M=XIII....) –L vagy R a jobb vagy bal kromoszóma kart jelenti –A három számjegy azt, hogy hányadik ORF a centromertől számítva az adott kromoszóma karon –C vagy W a ”Crick” vagy ”Watson” szálat jelenti, vagyis az ORF irányát Néhány gén nem ezt a nomenklatúrát követi, amit már ismernek: HO, MATa, MAT 

18 Élesztő genetika: markerek és törzsek A genetikai bélyegekkel (markerek) követhetjük a kromoszómákat a genetikai keresztezéseknél és szelektálhatjuk a diploidokat. Ezek alapján szelektálhatjuk a transzformánsokat plazmiddal történő transzformáció, vagy a genomba történő gén integráció után Gyakori genetikai bélyeg az auxotrófia: HIS3, URA3, TRP1, LEU2, LYS2, ADE2 Az ade2 mutáció nagyon hasznos, specifikus tulajdonsága van: a sejtek pirosak lesznek Az élesztő genetika első markerei fermentációs markerek voltak, vagyis néhány szubsztrát hasznosítását kódoló gének: SUC, MAL, GAL A SUC gének (SUC1-7) invertázt kódolnak (periplazmás enzim) és különböző élesztő törzsekben különböző kromoszómákra térképeződnek (telomer lokáció) MAL lokuszok (MAL1-6) három gént kódolnak: maltáz, maltóz transzporter és egy transzkripciós aktivátor; synthen telomer lokáció GAL gének a galaktóz felvételt és a glükóz-6-foszfáttá konvertáló enzimeket kódolják Mint az E. coli- nál itt is használunk néhány antibiotikum rezisztencia gént transzformácóknál: kanamicin rezisztencia, kanR Sok élesztő törzset használnak a laboratóriumokban: W303-1A, S288C,  1278b, SK1, BY Sajátos tulajdonságaik nagyon különbözhetnek és különböznek a vad, vagy az ipari törzsektől Egy kedvenc törzs, a W303-1A teljes genotípusa a következő: MATa leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 mal0

19 Élesztő genetika: törzsek keresztezése Az élesztő genetika azon a lehetőségen alapul, hogy hogy két ellentétes párosítási típusú és eltérő mutációkat hordozó haploid törzset keresztezni lehet és diploid törzset kapunk A diploid törzset aztán már vizsgálni lehet, hogy például a haploid törzsek mutációja ugyanabban a génben, vagy pedig más génekben van-e A diploid spóráztatható, tetrádokat képez, a tetrádok mikromanipulátorral szétszedhetők, a spórák különálló telepeket képeznek, amelyek már tovább vizsgálhatók A múltban rengeteg ilyen keresztezést végeztek, hogy megállapíthassák a gének elhelyezkedését a kromoszómákon: meghatározták a két mutáció rekombinációs gyakoriságát (mindkét mutáció egy spórában, vagy pedig mutáció nélküli spóra), ami a genetikai távolság mérésére alkalmas A szekvencia meghatározása előtti utolsó géntérkép több mint 1000 gént tartalmazott és nagyon pontosnak bizonyult, ami az élesztő fantasztikus rekombinációs hajlandóságának is köszönhető Manapság a genetikai keresztezést (genetic cross) új mutánskombinációk elkészítéséhez használják, pl. kettős, háromszoros, négyszeres….. mutánsok, ezért is jó, ha ismerjük a genetikai keresztezések és a gén szegregáció néhány alapelvét A genom szekvencia ismeretében sem nélkülözhetjük az új mutánsok előállítását és screenelését, például azért, hogy találjunk a már ismert gének mellett újakat is amelyek részt vesznek ugyanabban az útvonalban. Az új mutáns genetikai analízise az első és nélkülözhetetlen lépése a jellemzésnek

20 Élesztő genetika: törzsek kersztezése Hogy két törzs kereszteződjön, öszzekeverjük agar táptalajon és hagyjuk, hogy párosodjanak, pl. MATa leu2 URA3 x MATalpha LEU2 ura3 A diploid sejteket, mert mindkét komplementáló markerre heterozigóták lesznek, leucin és uracil mentes táptalajon szelektálhatjuk A diploidok spóráztató táptalajon növesztve néhány nap múlva aszkuszokat (tetrád) képeznek A spórázás nitrogén éhezés mellett indul meg, pl. KAc táptalajon Az aszkusz fala specifikus enzimmel (pl. csiga gyomorból) emészthető és spórákat mikromanipulátorral elkülöníthetjük agar táptalajon Csírázás után a spórák telepeket képeznek és egyenként vizsgálhatóak Ez azt jelenti, hogy a meiózis utáni utódok közvetlenül vizsgálhatók (az egy sejt előnye) Gyakorlott genetikus már a növekedési erély alapján meg tudja mondani, hogy a mutációk hogyan váltak szét, mert a kettős mutáns gyakran lassabban nő, mint bármelyik egyszeres Egyébkent meg, a spórákból növekvő telepeket különböző táptalajokra replikázzuk, hogy meghatározhassuk tulajdonságaikat és követhessük a genetikai bélyeget

21 Élesztő genetika: törzsek keresztezése A spórák mating típusát úgy határozhatjuk meg, hogy komplementáló markerű teszt törzs pázsitjára replikázzuk, hagyjuk hogy párosodjanak, majd a diploidokat szelektív táptalajra replikázzuk: csak azok nőnek, amelyek párosodtak, tehát a teszt törzzsel ellentétes tipusúak voltak Egy genetikai keresztezés jegyzőkönyve két NaCl-ra érzékeny két törzs keresztezése után a lenti táblázathoz hasonló A markereket párosával összehasonlítva, sajátos mintázat alakul ki ott, ahol pl. mind a négy spóra különböző, vagy pedig két spórának ugyanaz a marker kombinációja; hogyan lehet ezt interpretálni? TetradSporeMATleuurahisSUCNaCl 1Aa Balpha Ca Dalpha Aa Ba Calpha Dalpha-+-+-

22 Először azt kell összegeznünk, hogy mi is történik a miózisban: az élesztő tetrád analízis nem más, mint közvetlenül megfigyelni a meiózis eredményét A diploid 2n, ennélfogva kromoszóma párjai vannak A DNS replikáció mindkét kromoszómáról két azonos kromatidát eredményez A kromoszómák párban vannak és közöttük történhet rekombináció Majd az első meiotikus osztódás elválasztja a kromoszómákat egymástól A második pedig a kromatidákat is, vagyis mindegyik spóra lényegében egy kromatidát jelent Élesztő genetika: meiózis

23 Élesztő genetika: a keresztezés eredménye Képzeljük el, hogy a LEU2 és az URA3 egymáshoz közel vannak ugyanazon a kromoszómán LEU2 ura3 leu2 URA3 LEU2 ura3 leu2 URA3  Abban a valószínű esetben, ha a két marker között nem következett be cross-over, minden haploid spóra úgy fog kinézni, mint a szülői haploid törzsek  Csak két típusú spórát kapunk, (leu + ura - ) és (leu - ura + ) spórákat  Ezért az ilyen tetrádot szülői ditipusnak nevezzük (parental ditype) PD

24 Élesztő genetika: cross over  Most azt képzeljük el, hogy a LEU2 és URA3 egymáshoz közel vannak ugyanazon a kromoszómán és közöttük átkereszteződés, rekombináció következik be LEU2 ura3 leu2 URA3 LEU2 ura3 LEU2 URA3 leu2 ura3 leu2 URA3  Ebben az esetben most is kapunk szülői típusú spórákat, de olyanokat is, amelyek a két marker új kombinációit tartalmazzák  Négy különböző spóra típust kapunk  Ezért az ilyen tetrád a tetratípus (tetratype) T

25 Élesztő genetika: két cross over  A LEU2 és az URA3 gének most is közel és ugyanazon a kromoszómán vannak, de két cross over lesz köztük, úgy hogy mind a négy DNS szál részt vesz a folyamatban LEU2 ura3 leu2 URA3 LEU2 URA3 leu2 ura3  Ebben az esetben csak olyan spórákat kapunk, amelyek különböznek a szülői haploid típusoktól  Két különböző típusú spórát kapunk  Ezért az ilyen tetrád a nem szülői ditipus (non parental ditype) NPD  A közeli kapcsoltság miatt az a legvalószínűbb, hogy nem lesz cross over és a legkevésbé valószínű az, hogy két cross over is lesz, ezért a tetrádok megoszlása PD > T > NPD, és relatív számokat a térképtávolság kiszámítására használhatjuk  Hogy a mutációk új kombinációit előállíthassuk (mint pl. leu2 ura3) annál több tetrádot kell megvizsgálnunk, minél közelebb van a két gén egymáshoz és ezt a fizikai távolság (kb-ban) alapján becsülhetjük, ami nagyon jól korrelál a genetikai távolsággal ( cM, centi Morgan). Két közeli gén esetében (1 cM ~ 1% rekombináns spóra) minimum 25 tetrádot kell statisztikailag elemezni,

26 Keresztezés különböző kromoszómákon lévő markerekkel  Most azt képzeljük el, hogy a LEU2 és az URA3 különböző kromoszómákon vannak LEU2 leu2 LEU2 ura3 leu2 URA3  A különböző kromoszómák az első meiotikus osztódás során véletlen szerűen kerülnek be az utód sejtekbe  Ezért a két tetrád típus egyforma gyakoriságú lesz, a szülői P és nem szülői ditípus NPD  Tehát a kapcsolt és a nem kapcsolt gének könnyen megkülönböztethetők tetrád analízissel, mert a nem kapcsolt gének esetében a PD=NPD, míg a kapcsolt géneknél PD>>NPD ura3 URA3 LEU2 URA3 leu2 ura3

27 Keresztezés különböző kromoszómákon lévő markerekkel  Legyen most a LEU2 és az URA3 különböző kromoszómán és crossing over következik be a centromer és a marker közötti részen LEU2 leu2 LEU2 ura3 LEU2 URA3 leu2 ura3 leu2 URA3  Most az URA3 eltérő alléljei csak a második meiotikus osztódás után válnak szét  Az eredmény egy tetra típusú tetrád  A fenti helyzet azt is jelenti, hogyha a markerek a centromertől távol vannak, akkor sok, ha pedig közel, akkor kevés T tetrád lesz  Mi lesz az eredménye a kettős cross overnek négy vagy három szál esetén?  A kettős cross over valószínűsége miatt a különböző tetrád típusok aránya nem kapcsolt gének esetében, amelyek nem kapcsoltak a centromerrel sem, a következő: 1:1:4 a PD:NPD:T-re  Ez azt is jelenti, hogy négy spórából egy lesz rekombináns, vagyis annak érdekében, hogy a gének (leu2 ura3) új kombinációját megkapjuk, elég egy tetrádot elemezni statisztikusan ura3 URA3

28 Élesztő genetika: mutáns készítés Az olyan mutációk, amelyek erősítik, vagy megszüntetik egy bizonyos fehérje funkcióját, nagyon hasznosak a sejt rendszerek vizsgálatánál A mutációk fenotípusa, a mutáns tulajdonságai, sokat elárulhatnak egy gén, egy fehérje, vagy egy útvonal funkciójáról Ez a megközelítés a szekvencia ismeretében és a teljes deléciós szet birtokában is igaz: a pontmutánsoknak más tulajdonságai lehetnek, mint a deléciós mutánsoknak Véletlen, vagy célzott mutációk: –Random mutagenezissel a gének kapcsolatát keressük bizonyos funkcióval/szereppel; új géneket, vagy ismert gének új funkcióját azonosíthatjuk –Véletlen mutagenezisnél az egész genom a célpont –Véletlen mutagenezis lehetséges egy bizonyos fehérje esetében is, a génjét in vitro mutagenizáljuk; ebben az esetben a funkcionális doméneket azonosítjuk –Célzott mutageneziskor kiütünk, vagy megváltoztatunk egy bizonyos gént in vitro, vagy in vivo módszerekkel Indukált, vagy spontán mutációk –A sejteket mutagénnel kezelve mutációkat indukálhatunk; ilyenkor persze több mutáció is kialakulhat sejtenként –Spontán mutáció „csak úgy” is bekövetkezhet, ilyenkor nagy valószínűséggel csak egy mutáció lesz a sejtben

29 Élesztő genetika: mutáns keresés Szűrés (screening), vagy szelekció –Mutáns szűréskor az ember egyenként teszteli a klónokat, hogy megtalálja az érdekes mutánsokat –Ezért egyszerre sok sejtet széleszt és megpróbálja megtalálni azokat, amelyek replikázás után nem nőnek bizonyos táptalajokon, vagy más a színük, vagy az alakjuk –Screeninghez általában indukáljuk a mutációkat, hogy növeljük a gyakoriságukat –De: a screeninghez petri csészék százai kellenek és általában több mint telepet kell vizsgálni Egy új szelekciós rendszer kifejlesztése a genetikai analízis művészete –Ha szelektáljuk a mutánst, akkor olyan körülményeket teremtünk, hogy a mutáns fenotípusnak növekedési előnye legyen –Más szavakkal kifejezve, az a feladat, hogy olyan körülményeket állítsunk elő és/vagy olyan törzseket, hogy a mutáns tudjon szaporodni, a vad típus pedig ne –Az elegáns screenelő rendszer lehetővé teszi, hogy spontán mutánsokat izoláljunk, mert 10 8 sejtet könnyedén széleszthetünk egy lemezre –A szelekciós rendszerek gyakran inhibítor- rezisztencián alapulnak Wild type hog1  sko1  aca1  aca2  hog1  aca1  aca2  hog1  sko1  aca1  aca2  YPD YPD + 0.4M NaCl Wild type aca2  hog1  hog1  aca2  YPD YPD + 0.4M NaCl

30 Ha már izoláltuk a mutánsokat, akkor azokat jellemezni kell és azonosítani kell az érintett géneket; a következők szerint Részletes fenotípus analízis, vagyis más, nem csak a szűrés/szelekció során használt fenotípusok vizsgálata Ki kell mutatni, hogy a mutáns domináns-e, vagy recesszív A mutánsokat komplementációs csoportokba kell rendezni. Egy komplementációs csoport általában egy gént jelent. A gén klónozása komplementációval. Élesztő genetika: mutánsok jellemzése

31 Domináns és recesszív fenotípus MUT1 mut1 Domináns: mutáns fenotípus Recesszív: vad fenotípus A domináns, vagy recesszív karakter felderíthető, ha a mutánst vad típussal keresztezzük, hogy diploid sejtet képezzenek Az ilyen diploidok heterozigóták, mert az egyik kromoszómájukon a vad allél, a másikon pedig az érintett mutáns allél van A mutáció domináns, ha a mutáns fenotípus nyilvánul meg a heterozigóta sejtekben. A diploid fenotípusa ugyanolyan, mint a haploid mutánsé Egy mutáció recesszív, ha a vad típusú fenotípus nyilvánul meg a heterozigóta diploidban. A diploid fenotípusa olyan, mint a vad típus.

32 Domináns és recesszív mutáció MUT1 mut1 Domináns: mutáns fenotípus Recesszív: vad fenotípus Domináns karakter számos ok miatt lehet, amelyek segíthetnek a géntermék szerepének felderítésében: –A mutáció funkció nyerést okoz (gain of function), azaz a szabályozó fehérje akkor is működik, ha nincs a szokásos stimuláció –A géntermék homo-oligomerként működik és a nem-funkcionális monomer az egész komplex működését elrontja –Az egyetlen vad típusú allél kevés a vad típusú fenotípushoz, azaz nincs elég működőképes géntermék (nagyon ritka) A recesszív karaktert gyakran a géntermék funkció vesztése (loss of function) okozza. Ez azt is jelenti, hogy a recesszív mutáció sokkal gyakoribb, mert könnyebb valamit elrontani, mint előállítani Mutánsunk további genetikai analízise a domináns/recesszív jellegtől függ, ezért is ez az első lépés Aztán még, hasznos, ha a diploid tetrád analízisét elvégezzük, hogy kiderítsük, hogy a mutáns fenotípust egyetlen mutáció okozta-e; a fenotípusok 2:2 arányban szegregálnak legalább tíz megvizsgált tetrádban; ez különösen fontos, ha indukáltuk a mutációt.

33 Komplementációs csoportok mut1 MUT1 mut1 mut2 MUT2 Bizonyos fenotípusú mutánsok szelekciója/screeningje és a domináns/recesszív jelleg meghatározása után tudni szeretnénk, hogy az izolált mutánsok azonos, vagy különböző génekben érintettek-e Recesszív mutációkra ezt komplementációs analízissel derítjük ki Ehhez eltérő párosodási típusú mutánsok kellenek, hogy diploidokat állíthassunk elő (ezt úgy érhetjük el, hogy a mutánsokat már eleve más párosodási csoportba tarozó és komplementáló markerű törzsből készítjük) A mutánsokkal aztán minden lehetséges kombinációban diploidokat képeztetünk; ami azt jelenti, hogy ha pl. 12 a-típusú és 9 alfa-típusú mutánsunk van, akkor 9x12=108 kersztezés lehetséges. Ha két mutánsunknak recesszív a mutációja egy és ugyanazon génben, akkor a diploid szintén mutáns fenotípusú lesz Ha a két haploid recesszív mutációja két különböző, de ugyanolyan fenotípust okozó génben van, akkor a mutánsok komplementálják egymást és a diploid vad fenotípusú lesz. Ezért, ha a mut1 és a mut2 két különböző komplementációs csoportot reprezentál, nagy valószínűséggel különböző géneket jelentenek MUT1 –nek nincs működő génterméke MUT1 és MUT2-nek működő génterméke van

34 Intragénes komplementáció mut1-1 mut1-2  Az intragénes komplementáció ugyan ritka, de előfordul  Két mutáns allél, mint pl. a mut1-1 és a mut1-2, a haploid sejtekben egyértelmű mutáns fenotípust okoz és recesszívek  A heterozigóta mut1-1/mut1-2 viszont (részben) vad típusú  Az a magyarázat, hogy a két mutáns fehérjetermék, a Mut1-1p és a Mut1-2p olyan heteromert képeznek, amelyik egy kicsit működik  Ezt néhány metabolizmus enzim esetében tudták jól kimutani (ILV1, egy feedback szabályozott enzim az aminosav bioszintézisben)  Az intragénes komplementáció jelensége azt mutatja, hogy a géntermék oligomerként funkcionál  Az ”ellentéte”, a nem-alléles nem komplementáció is előfordulhat természetesen: két recesszív mutáció két különböző génben nem komplementálnak. Ez akkor fordulhat elő, ha a két géntermék ugyanabban a folyamatban, vagy komplexben vesz részt és két működő allél kevés a teljes működőképességhez MUT1 –nek nincs működő génterméke De a Mut1-1p és Mut1-2p heteromer lehet működőképes

35 Klónozás élesztőben Az élesztő molekuláris genetika 1978-ban kezdődött, amikor a S. cerevisiae –t sikeresen transzformálták idegen DNS-sel Számtalan transzformációs módszer van, de a legjobb is legalább három nagyságrenddel rosszabb hatékonyságú, mint az E. coli transzformáció Az élesztőben replikálódó plazmidok kópiaszáma egy és ötven között van sejtenként Az élesztő többféle plazmidot is elvisel egyszerre. Ez komplikálhatja a génkönyvtárakból való klónozást. Ez ugyanakkor nagyon hasznos, ha két plazmiddal egyszerre akarjuk transzformálni az élesztőt, pl. a plazmid shuffling módszer esetében A plazmid tisztítás élesztőből és a klónozás élesztőben nem hatékony Ezért az E. coli-t használjuk plazmid termelésre: A plazmidokat in vitro készítjük, E. coli-t transzformálunk, ellenőrizzük a konstrukciót a baktériumban termeltetjük a plazmidot és végül transzformáljuk az élesztőt Ezért úgynevezett élesztő- E. coli ingázó vektorokkal (shuttle vector) dolgozunk Ugyanakkor az élesztő homológ rekombináiós rendszere nagyon hatékony és megbízható, amit kihasználhatunk a klónozásnál

36 Élesztő-E. coli ingázó vektorok Integrálódó plazmidok (YIp) felépítése –E. coli vektor alap, mint a pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT –Élesztő szelekciós marker marker (URA3, HIS3, TRP1, LEU2) Nincs élesztő replikációs origó Ezért csak a genomba való beépülés után tarthatók fenn YIp5 5541bp URA3 PMB1 Ava I (2541) Bam H I (379) Cla I (28) Eco R I (2) Hin d III (33) Nco I (1867) Sma I (2543) Xma I (2541) Pst I (1644) Pst I (4795) Apa LI (3473) Apa LI (3971) Apa LI (5217) Amp-rezisztencia Tet-rezisztencia YIp5: pBR322 + URA3 gén

37 Plazmid beépülés az élesztő genomba A beépülés homológ rekombinációval történik, ez azt jelenti, hogy az olyan plazmidok, mint pl. az Ylp5 az URA3 lokuszba integrálódik A bépülés eredményeként a célszekvencia megkettőződik A duplikálódott DNS határolja a vektort Ha a plazmidban több mint egy élesztő gén van, akkor az egyik gént enzimmel hasítva célzottan abba a génbe irányíthatjuk a plazmidot: a lineáris DNS rekombinációs hajlama igen nagy Az integrálódott plazmid nagyon stabilan a helyén marad, bár a duplikálódott szekvenciáknál néha rekombinációval ki is hurkolódhat URA3ura3 X URA3 ura3 X plazmid genom

38 Élesztő-E. coli ingázó vektorok A replikatív episzómás plazmidok (YEp) felépítése –E. coli vektor alap (pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT) –Élesztő szelekciós bélyeg (URA3, HIS3, TRP1, LEU2) Az élesztő 2μ-os plazmid replikációs origó Viszonylag stabilan kópia sejtenként Kópiaszámuk növelhető 200/sejt-re a részlegesen defektív LEU2 gén felhasználásával YEp24: pBR322 + URA3 gén, + 2μ origó YEp bp URA3 PMB1 2μ ORI Bam H I (3785) Cla I (2268) Nco I (2705) Sma I (3381) Xma I (3379) Eco R I (2) Eco R I (2242) Apa LI (5701) Apa LI (6199) Apa LI (7445) Ava I (1391) Ava I (3379) Ava I (4835) Hin d III (106) Hin d III (2273) Hin d III (3439) Pst I (2001) Pst I (2482) Pst I (7023) Amp-rezisztencia Tet-rezisztencia

39 Élesztő-E. coli ingázó vektorok  A replikatív centromerás plazmidok (YCp) felépítése E. coli vektor alap (pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT) –Élesztő szelekciós bélyeg (URA3, HIS3, TRP1, LEU2)  És még egy élesztő kromoszóma replikációs origó, ARS (autonomously replicating sequence)  Valamint egy élesztő kromoszóma centromer (CEN)  Ezért stabilak, egy kópia sejtenként YCp50: pBR322 + URA3 gén, + CEN4, + ARS1

40 Élesztő-E. coli ingázó vektorok  Plazmid sorozatok  E. coli klónozó vektor alap  Egy, vagy több élesztő szelekciós bélyeg  Alap típusok YIp, YCp ésYEp  YIp típusú csak integrációra  YCp kis kópiaszám, expresszióra  YEp túltermeltetésre

41 Komplementációs klónozás Amikor már izoláltuk és komplementációs csoportokba rendeztük a mutánsokat, a génről még mindig nem sokat tudunk ( és ez gyakran még most, a teljes genom szekvencia ismeretében is így van!) A génazonosításához klónozzuk egy génkönyvtárból a mutáció komplementációjával A génkönyvtár egy olyan nagy plazmid populáció, ahol a plazmidokban az élesztő genom DNS-ének különböző fragmentumai vannak, amelyek összességében a teljes élesztő genomot reprezentálják A génkönyvtárat úgy készítjük, hogy a teljes élesztő DNS-t pl. a gyakori hasító hellyel rendelkező Sau3A-val (GATC) csak részlegesen emésztjük; így egymással átfedő DNS fragmentumokat kapunk, ami biztosítja, hogy minden génből legyen működőképes génünk; a Sau3A fragmentumokat a kompatibilis BamHI-el (GGATCC) emésztett vektorba ligáljuk; minden élesztő könyvtárat hasonló elven készítettek Ha klónozott DNS fragmentumok átlagos mérete 5-9 kbp, a genom egyszeres reprezentációja plazmidban van és plazmidban több mint 90%-os valószínűséggel az összes gén működőképesen található meg A teljes könyvtárral transzformáljuk a mutánsunkat A transzformált sejteket a vad fenotípus helyreállítására szűrjük, vagy szelektáljuk A pozitív klónokból plazmidot izolálunk és ezekkel E. coli-t transzformálunk és tovább vizsgáljuk; a szekvencia igazolja a klónunkat Klónunkkal újra transzformáljuk a mutáns élesztőt és ezzel igazoljuk, hogy a plazmid valóban tartalmazza a komplementáló gént; ez azért szükséges, mert az élesztő többféle plazmidot is képes felvenni

42 Komplementációs klónozás A komplementációs klónozás nagyon egyszerűnek és üdvözítőnek tűnik, de azért jó néhány gond lehet vele Először is, csak recesszív mutánsokkal lesz sikeres Domináns mutáns gének klónozásához minden egyes mutánsunkból génkönyvtárat kell készíteni és ezekkel transzformáljuk a vad típusú törzset; a mutáns fenotípusra szűrjük/szelektáljuk a transzformánsokat Továbbá, egy mutáció komplementációja nem biztos, hogy azt jelenti, hogy valóban a klónozott génünk az ami komplementálja a mutánsunk hibáját – ez lehet egy sokkópiás szupresszor is Ez előfordulhat a centromerás vektorokkal is, mert a szelekciós nyomás ezeknek a plazmidoknak is föltornázhatja a kópiaszámát A sokkópiás szupresszor egy olyan gén, amelyik felülkerekedik a mutáns hibáján, ha nagy mértékben megnyilvánul; ez gyakori jelenség Ez valóban olyan gyakori jelenség, hogy bizonyos mutánsokkal elkezdve új géneket klónozhatunk (még erre visszatérünk) Azt kimutatni, hogy a klónozott génünk az egyetlen, amelyik hibás a mutánsunkban, úgy lehet, hogy a klónozott génünket templátként használva, homológ rekombinációval deléciós mutánsokat készítünk Ha az eredeti és a deléciós mutáns is ugyanazt a fenotípus mutatja, akkor ez jó bizonyíték arra, hogy a két gén azonos Végső bizonyítékot a két mutáns keresztezéséből kaphatunk; ha a diploid is mutáns fenotípusú és a diploidból izolált valamennyi spóra is, ez már bizonyítja a két gén azonosságát A gének deléciója homológ rekombinációval az egyik leghatékonyabb technika az élesztő esetében és ez is az egyik ok, amiért az élesztő ilyen népszerű

43 Komplementációs klónozás Ha az eredeti mutáns és a deléciós mutánsnak ugyanaz a fenotípusa, akkor ez jó bizonyíték arra, hogy a két gén azonos A végső bizonyítékot a két mutáns keresztezése szolgáltatja; ha a diploid mutáns fenotípusú (vagyis nincs komplementáció az eredeti és a deléciós mutáns között) biztosak lehetünk abban, hogy a klónozott génünk az amelyik eredetileg elromlott A 100%-os bizonyosság kedvéért spóráztatjuk a diploidot és néhányszor tíz tetrádot megvizsgálunk: minden spóra mutáns fenotípusú kell legyen A gének deléciója homológ rekombinációval az egyik leghatékonyabb technika az élesztő esetében és ez is az egyik ok, amiért az élesztő ilyen népszerű mut1  mut1 MUT1 mut1  mut2 MUT2 MUT1 génnek nincs funkcionális génterméke MUT1 és MUT2 gének funkcionális géntermék

44 Egy élesztő gén deléciója A klónozott gén felhasználásával a nyitott leolvasási keretetből in vitro kivágunk egy darabot és kicseréljük egy marker génre A marker génünket így az eredeti génünkből származó szekvenciák határolják Ezzel a DNS-sel transzformáljuk az élesztőt, ahol homológ rekombinációval a kromoszómán lévő gén erre cserélődik ki; a transzformánsokat a marker génre szelektáljuk Ezt követően Southern blot-tal (DNS-DNS hibridizálással), vagy PCR-rel és az élesztő törzs fenotípusának vizsgálatával igazoljuk a deléciót A módszer igen megbízható és 1µg DNS-sel biztosan kapunk néhány transzformánst. Ugyanez növény-, vagy állat-sejtekkel eltarthat néhány évig. YFG1 Kedvenc génje egy plazmidban URA3 Kedvenc génje a plazmidban, az ORF a mrker génre cserélve Kedvenc génje eltávolítva a genomból X X Rekombináció az élesztőben URA3 in vitro in vivo

45 Egy élesztő gén deléciója Több lehetőségünk is van a transzformáló DNS elkészítésére, mármint hogy a markert a YFG1 génből származó szekvenciák fogják közre –Elkészíthető restrikciós endonukleázokkal (RE) és ligálással –Ekészíthető: PCR/restrikció/ligálás; az egész plazmid amplifikálható PCR-rel az ORF kivételével; a PCR primerekkel generálhatjuk a marker gén klónozására alkalmas RE hasító helyet –Elkészíthető csak PCR-rel, minden klónozási lépés nélkül; két külön PCR reakcióban amplifikáljuk a YFG1 határoló szakaszait és a második körben ezeket használjuk primerként a marker gén sokszorozáshoz, a primereket természetesen ennek megfelelően kell megtervezni (lásd lent) –Elkészíthető hosszú PCR primerekkel, melyekkel csak a markert amplifikáljuk, a rekombináció pedig a primer szekvenciáknál következik be; 30 bp már elegendő a rekombinációhoz; ilyen esetekben heterológ marker ajánlott, hogy a beépülés a megfelelő helyre történjen –A két utóbbi módszerhez nem szükséges a klónozott gén!! Egy gén deléciója így csak néhány nap. YFG1 Először PCR-rel amplifikáljuk a kedvenc génünk határoló szakaszait URA3 A kész PCR termék kész a transzformációra URA3 Majd a markert amplifikáljuk

46 Okos gén deléció Az alkalmazott marker kazettától függően, nagyon okosan készíthetjük el a deléciós/megszakításos (gene disruption) mutánsunkat, a későbbi alkalmazásokhoz Például, ha a marker kazettánk tartalmazza a lacZ riporter gént, akkor pontos fúziót tudunk előidézni azért, hogy a riporter gént a YFG1 promótere szabályozza Ha ilyen konstrukcióval készítünk deléciót egy diploidban, akkor vizsgálhatjuk a gén megnyilvánulását a diploidban a β-galaktozidáz enzim aktivitásának mérésével és spóráztatás után a mutáns fenotípust a haploid utódokban. Hasonló módon meg is jelölhetünk egy gént (gene tagging). Ha például a kazettát frame-ben építjük be az ORF valamelyik végéhez, akkor fúziós fehérjéket kapunk, LacZ, GFP, vagy immuno-tag jelöléssel a fehérjénk kimutatásához, vagy tisztításához URA3 lacZ YFG1 Diploid sejt

47 Okos gén deléció Hasonló módon meg is jelölhetünk egy gént (gene tagging). Ha például a kazettát frame-ben építjük be az ORF valamelyik végéhez, akkor fúziós fehérjéket kapunk, LaZ, GFP, vagy immuno- tag jelöléssel a fehérjénk kimutatásához, vagy tisztításához Már elkészítették azokat az élesztő törzseket, amelyekben a géneket GFP, vagy TAP-tag-el jelölték YFG1 URA3 GFP

48 Van néhány lehetőség arra, hogy úgy készítsünk deléciós törzseket, hogy ne maradjon utána nyom, azaz marker gén nélkül Ez akkor nagyon fontos, ha a markert újra használni akarjuk, azért, hogy sok deléciót készíthessünk egy és ugyanazon törzsben ( vannak olyan törzsek, amelyekben több mint húsz deléció van) Különösen fontos ez az ipari törzsekben; amikor is számít, hogy fölösleges idegen DNS ne maradjon vissza a folyamat végén Az összes ilyen módszer is a homológ rekombinációt használja ki másodjára, hogy az integrálódott DNS kihurkolódjon Erre jók például a loxP-kanR-loxP kazetták; a két loxP kazetta közötti rekombinációt a Cre-rekombináz (külön plazmidon transzformálva) stimulálja; rekombináció után egyetlen loxP hely marad vissza (cre-lox a P1fágból) Okos gén deléció

49 Nagyon hasznos az URA3 markerrel dolgozni, mert ennek jelenlétében lehet erre is, meg ellene is szelektálni URA3 –ra természetesen uracil mentes táptalajon szelektálunk Az URA3 ellen az 5-fluoro-orotic acid (5-FOA) droggal szelektálhatunk, ami az URA3 sejtekre toxikus Egy példa: URA3 plazmid genom YFG1 Csak az YFG1 határoló szekvenciáit tartalmazó plazmid beépüése duplikációt okoz; a kék szekvenciák közötti rekombináióval a teljes plazmid és még az YFG1 gént kódoló régió is kihurkolódik

50 Hogyan dolgozzunk esszenciális génekkel? Tárgyaltuk a kémiai és a célzott mutagenezist; kézenfekvő kérdés, hogy hogyan is izoláljunk és dolgozzunk olyan mutánsokkal, amelyekben a mutáció a sejt számára nélkülözhetetlen termékeket kódoló génekben van (és ilyen kb. a gének 1/3-a)? Az a mutáció ugyanis, amelyik tönkreteszi a géntermék fehérjét, megöli a sejtet és döglött sejttel nehéz dolgozni. Kémiai mutagenezisnél kondicionális mutánsokat keresünk; általában hőérzékeny (ts) mutánsokat, ahol a géntermék alacsony hőmérsékleten működőképes, magas hőmérsékleten pedig nem; nagyos sok esszenciális sejtfunkciót ts mutánsokkal azonosítottak Deléciós kísérletekben úgy döntjük el azt, hogy egy gén nélkülözhetetlen, hogy a deléciót diploid törzsben készítjük; és ha spóráztatás után csak két spóra lesz életképes és egyetlen élő spóra sem hordozza a markert, akkor elismerhetjük, hogy a gén esszenciális Dolgozhatunk nélkülözhetetlen gének mutánsaival is. Elsősorban akkor, ha a mutánst olyan plazmiddal transzformáljuk, amelyik a kérdéses gént kondicionálisan expresszálja Például, ha a plazmidban az esszenciális gént a GAL1 gén promótere működteti; ez a promóter bekapcsolható galaktózzal, glükózzal pedig kikapcsolható; ha glükózra váltunk, akkor legalábbis egy kis ideig vizsgálhatjuk a sejtek tulajdonságait …. és vizsgálhatjuk pusztulás közben (yfg1  pGAL1-YFG1) Az in vitro készített pontmutánsok működését vizsgálandó, használhatjuk a plazmid shuffling technikát. Ilyenkor a mutánst először a vad típusú gént tartalmazó plazmiddal transzformáljuk, majd a mutáns génnel. A vad gént hordozó plazmidon kel legyen az URA3 mint szelektálható marker, amit aztán 5-FOA tartalmú táptalajra szélesztve a transzformánsokat arra kényszerítjük, hogy tűnjön el a sejtből. Ha a mutáns nő 5-FOA jelenlétében, akkor a mutáns allél működőképes (yfg1  pURA3::YFG1 pLEU2::yfg1-1).

51 A gén-megszakítástól a transzpozon mutagenezisig A gén deléció/megszakítás technikák egy lépéssel messzebbre vezetnek a véletlen kémiai mutagenezisnél Ezért, mint már korábban tárgyaltuk, génkönyvtárat készítünk úgy, hogy a beépített élesztő DNS-t csak az élesztő genomot nagyon ritkán hasító NotI enzimmel vághassuk ki Majd ezt a génkönyvtárat E. coli-ban transzpozonnal mutagenizáljuk, ahol is a Tn véletlenszerűen épül be az élesztő DNS-ekbe Ezt követően a teljes NotI fragmentum keverékkel transzformáljuk az élesztőt és azt várjuk, hogy ott kicseréli a géneket; kb élesztő klón a genom több mint 90 %-át lefedi Az ábrán lévő transzpozon egy igen jó konstrukció, mert a lox helyeknél részlegesen ki lehet vágni. A kivágódás után egy tag képződik, ami a géntermék lokalizációját teszi lehetővé.  TR: Tn3 terminális inverted repeat-ek  Xa: Xa faktor hasítás felismerő helye  loxR: lox hely, a Cre rekombináz célhelye  lacZ: 5'Δ lacZ gén  - galaktozidázt kódol  URA3 gén S. cerevisiae-ből  tet: tetraciklin rezisztencia gén  res: Tn3 resolúciós helye a transzpozon intermedier megoldódásához  loxP: lox hely, a Cre rekombináz célhelye  3xHA: Hemagglutinin (HA) tripla epitope tag

52 A gén-megszakítástól a transzpozon mutagenezisig A Tn mutagenezis azért igen hasznos és kedvelt, mert a Tn-inzerciós gén nagyon könnyen azonosítható, mert DNS-t tisztítunk a mutánsból és olyan enzimmel emésztjük, amelyik nem vág a transzpozonba A képződött sok DNS fragmentumból csak kromoszómánként egy fogja tartalmazni a transzpozont, amit élesztő DNS fog közre Ligálással gyűrűs plazmid DNS-t készítünk, E. coli-t transzformálunk és a plazmidot tovább vizsgáljuk A transzpozonból az élesztő DNS felé mutató primerrel szekvenálunk és a genom szekvenciával összehasonlítva megtudhatjuk melyik génről van szó Ez a módszer olyan jól működik, hogy összehasonlító géntérképezésre is felhasználták Például, mostanában screeneltek Tn-mutánst több tulajdonságra és sok eddig még nem jellemzett stressz toleranciával kapcsolatos gént lokalizáltak A transzpozon antibiotikum rezisztens származékai hasznos eszközei az ipari törzsek mutációjának és vizsgálatának

53 Klónozás lyuk foltozással (gap repair) Az élesztő hatékony rekombinációs rendszerét több módon is felhasználhatjuk, hogy lyukas plazmid foltozással klónozzunk géneket Az az alapja, hogy a lyukas, lineáris plazmid nem replikálodik az élesztő sejtekben, hacsak nem javítódik ki gyűrűs plazmiddá A lyukat a kotranszformált (részben) homológ DNS foltozza be rekombinációval; ezt felhasználhatjuk mutációk generálására, pl. error-prone PCR-rel. Megemlítendő, hogy egyébként a résztvevő DNS daraboknak nem kell magából az élesztőből származni! Ez igen hatékonyan működik. A genomi DNS-sel való rekombinációval és gén konverzióval is bekövetkezhet a javítás; ezt a genomi mutáns allél klónozására használhatjuk „lyukas” plazmid Javító fragmentum „lyukas” plazmid genomi kópia foltozza be a „lyukat”; a templát duplikálódik YFG1

54 Fehérjék lokalizálása a sejtben: GFP A zölden fluoreszkáló fehérjét (GFP) használják a fehérjék szisztematikus lokalizálására az élesztő sejtben A GFP technológia nagy előnye, hogy élő sejtekben figyelhetjük meg a folyamatokat! Általában a GFP-t kódoló szekvenciát a vizsgálandó gén kódoló régiójának valamelyik végéhez fúzionáltatjuk (transzlációs fúzió) Ezt plazmidban és a genomban is elkészíthetjük A konstrukció működőképességét a megfelelő deléciós mutáns komplementációjával vizsgáljuk A GFP zölden világít a fluoreszcencia mikroszkópban és szubcelluláris helyzetét a különböző kompartmentek kontroll festése alapján állapíthatjuk meg. Ma már többféle GFP variáns is van, eltérő kimutathatósági küszöb értékekkel és különböző színű fényemisszióval: CFB, BFP, RFP, YFP… Ezzel lehetővé vált több fehérje szimultán megfigyelése a sejtben és még a fehérje- fehérje kölcsönhatások is vizsgálhatók

55 Lépjünk tovább: még gén izolálás Eddig már beszéltünk arról, hogy hogyan készítünk különböző módon mutációt élesztőben: –random kémiai mutagenezis –random célzott mutagenezis transzpozonnal jelölt DNS-sel –élesztő gének célzott deléciója/inzerciója és megismerkedtünk az élesztő gének vizsgálatának és konstruálásának néhány módszerével –fúzió riporter génnel a gén expresszió vizsgálatához –fúzió epitóppal, vagy GFP-vel a fehérje koncentráció, vagy a sejten belüli lokalizáció vizsgálatára A genetikai analízis ereje abban a lehetőségben is megmutatkozik, hogy egy gént/mutánst felhasználhatunk további gének izolálására, amelyek ugyanabban, vagy párhuzamos, vagy azzal kapcsolatban lévő folyamatokban résztvevő fehérjéket kódolnak Ugyanezek a genetikai megközelítések használhatók arra, hogy meghatározzuk különböző gének/fehérjék részvételét ugyanabban (vagy másik) sejtfolyamatban és hogy sorba rendezzük azokat, például egy jelátviteli útban Ilyen továbblépési lehetőség a –Sokkópiás szupresszió –Szupresszor mutáció –Mesterséges letalitás (synthetic lethality) –Az élesztő kéthibrid rendszer Ezeket a rendszereket többféle variációban lehet használni; az igazi szellemi teljesítmény az, hogy megtaláljuk azokat a körülményeket, amelyek lehetővé teszik a módszerek célravezető alkalmazását

56 Szupresszorok Definíció: egy mutáns reverziója azt jelenti, hogy az eredeti lézió (hiba) kijavítódik és ezért az eredeti, a vad típusú helyzet áll vissza; egy deléciós mutáns természetesen sohasem revertál Definíció: a szupresszor egy gén, vagy mutáció, ami (részlegesen) felülkerekedik egy adott mutáció okozta hatáson; ezért a szupresszor egy másik helyen bekövetkező genetikai változás, ami valahogyan (részlegesen) helyreállítja a vad típusú helyzetet A szupresszorok lehetnek intragénesek (génen belüliek), vagyis egy második mutáció ugyanabban a génben/fehérjében helyre tudja állítani (részlegesen) a géntermék működőképességét; ismételten, ez csak pontmutációk esetében igaz, deléciós mutánsokra nem Sokkal gyakoribbak az extragénes (génen kívüli, gének közötti) szupresszorok és szó lesz a sokkópiás szupresszorokról és a szupresszor mutációkról Hogy a szupresszor hogyan működik, az természetesen nagymértékben függ a vizsgálati rendszertől; a szupresszor működés vizsgálata rengeteg fontos információt szolgáltat Elsősorban, a szupresszor, vagy aktiválja (vagy represszálja) az első mutáció által érintett rendszert valamilyen más módon, vagy pedig aktivál (vagy represszál) egy alternatív, részben redundáns rendszert A szupresszorok nagyon hasznosak, de ugyanakkor bosszantóak is lehetnek: a gyengén növekvő élesztő mutánsok könnyen generálnak szupresszorokat, ezért az embernek óvatosnak kell lennie, ha ilyen mutánsokkal dolgozik

57 Sokkópiás szupresszió (multi-copy suppression) A sokkópiás szupressziót egy gén túlműködése okozza, általában sokkópiás plazmidról, vagy egy „szokatlanul” erős promóterről (mutáció, áthelyeződés) A sokkópiás (vagy géndózis) szupresszor egy gén, ami ha nagymértékben nyilvánul meg, akkor felülkerekedhet (részben) egy bizonyos mutáció okozta hatáson A sokkópiás szupresszió, mint a génfelfedezés eszköze nagyon izgalmas eszköz: sohasem tudhatjuk, hogy mit találunk… De általában azt várhatjuk, hogy olyan gén lesz, amelyiknek génterméke egy későbbi funkció ugyanabban az útvonalban, vagy pedig egy párhuzamos útvonalban Az a szép benne, hogy azonnal megkapjuk a gént! Az érvelést körüljárva: ha más genetikai kísérletekből tudjuk már, hogy két gén funkcionálisan kapcsolatban van, akkor a két fehérjét sorrendbe állíthatjuk episztázis analízissel: csak olyan gén terméke képes egy mutáció sokkópiás szupressziójára, amelyiknek terméke az útvonalban később működik X Pbs2p és Hog1p ugyanabban az útvonalban vannak és Hog1p-t Pbs2p aktíválja. Túltermelt Hog1p-nek lehet elegendő aktivitása a szükséges funkcióhoz Pbs2p nélkül is X közös target Két párhuzamos útvonalnak van egy, vagy több közös targetje. A párhuzamos útvonal expressziójának megnövekedése, ennek következtében a nagyobb aktivitás elegendő lehet a target aktíválásához.

58 Szupresszor mutációk Egy extragénes szupresszor mutáció úgy változtat meg egy másik gént, hogy egy bizonyos mutáció hatásait, vagy egyik hatását megszünteti, felülkerekedik rajta A sokkópiás szupresszióhoz hasonlóan számtalan lehetőség van arra, hogy bekövetkezzen és a végeredmény gyakran meglepő, de igen informatív Tipikus szupresszor mutációk azok, amelyek egy, a primer lézió utáni gén termékét aktiválják ugyanabban az útvonalban; ezek általában funkció nyeréses mutációk és rendszerint dominánsak Más tipikus mutációk esetében a mutáció kiüt egy downstream represszort ugyanabban, vagy pedig egy párhuzamos útvonalban: ezek a mutációk funkció vesztéses mutációk, recesszívek A szupresszor mutáció aktiválhat, vagy inaktiválhat olyan útvonalakat/rendszereket amelyek valamilyen módon ugyanazt a fizológiai rendszer befolyásolják, mint a primer lézió Ha az adott fehérje egy multimer komplex része és a primer mutáció egy pontmutáció, akkor a következő, az extragénes szupresszor mutáció eredménye az is lehet, hogy a fehérje kölcsönhatások ismét lehetségessé válnak, ezért ezzel a módszerrel kölcsönható fehérjéket is azonosíthatunk Pbs2p és Hog1p ugyanabban az útvonalban vannak és Hog1p-t Pbs2p aktíválja. A mutáció miatt Hog1p aktív lesz aktiválás nélkül is és szupresszálja a pbs2 primer mutációt; és valószinüleg domináns Az útvonal végül inaktivál egy negatív szabályozót, pl. a Sko1p represszort; a represszor kiütése miatt az útvonal aktív lesz; a mutáció nagy valószínűséggel recesszív

59 Mesterséges (?) letalitás (synthetic lethality) A mesterséges letalitás hatékony eszköz olyan gének azonosításához, amelyeknek termékei (egy útvonalban) párhuzamosan működnek azzal a génnel, amit a primer mutáció érintett. A két mutáns külön-külön életképes, de a kettős mutáns nem!! A lényeg: a primer mutánst egy, a megfelelő gént tartalmazó plazmiddal transzformáljuk; a gént vagy a GAL1 promóter hajtja meg (galaktózon BE, glükózon KI), vagy pedig egy az 5-FOA-val ellenszelektálható URA3 markert is tartalmazza Olyan mutációkra screenelünk aztán, amelyek lehetővé teszik azt, hogy az élesztő csak a plazmid jelenlétében tudjon szaporodni (azaz nem nő 5-FOA-án), vagy pedig csak akkor, ha a gén megnyilvánul (azaz nem glükózon) Ez az alapelv olyan jó, hogy a mesterséges letalitás screeninget most már a teljes genommal csinálják, amihez a deléciós mutáns kollekciót használják: ez 4200 x 4200 keresztezést jelent, a spóráztatást és a tetrád analízist pedig robotok végzik A két útvonal néhány közös célpontot szabályoz; a PBS2 muációja magában csak gyenge fenotípust eredményez. A párhuzamos útvonalban bekövetkező második mutációval már letális.

60 Episztázis I (epistasis analysis)  A szupresszor analízis és a mesterséges letalitás tárgyalása közben megismert fogalmak az alapjai a genetika egyik másik hatékony eszközének, az episztázis analízisnek  Bizonyos mértékben hasonlít a komplementációs analízishez (A mutáns kollekciónkban hány különböző gén okozza ugyanazt a fenotípust ?), az episztázis analízis azt kérdezi, hogy hány gén/fehérje van ugyanabban a genetikai rendszerben/útvonalban és milyen sorrendben működnek?  Az alapelképzelés az, hogy két mutációt kombinálunk ugyanabban a sejtben, azaz kettős mutánsokat készítünk; a kettős mutáns fenotípusa megmutathatja azt, hogy a két géntermék ugyanabban, vagy párhuzamos útvonalban dolgozik-e és megmutathatja az útvonalon belüli sorrendjüket..  Elsőként feltételezzük azt, hogy mind a négy fehérjének a mutánsai hasonló fenotípust, pl. mérsékelt só érzékenységet okoznak  Ha a hog1 és a pbs2 mutációkat kombináljuk egy hog1 pbs2 mutánsban, azt várhatjuk, hogy a kettős mutánsunk érzékenysége ugyanolyan mértékű lesz, mint bármelyik egyszeres mutánsé; arra következtethetünk, hogy ugyanabban az útvonalban működnek  Ha viszont a pbs2 és a cba1 mutációkat kombináljuk a pbs2 cba1 kettős mutánsban, a kettős mutánstól sokkal nagyobb érzékenységet várhatunk az egyszeres mutánsokhoz képest; arra következtethetünk, hogy a Pbs2p és a Cba1p másik, de párhuzamos útvonalak munkásai

61 Episztázis II  Feltételezzük most azt, hogy a PBS2 (és a HOG1) deléciója következtében az élesztő a nagy só koncentrációra érzékeny lesz, míg a SKO1 deléciója sóval szembeni nagyobb toleranciát okoz  Ha ezek a fehérjék ugyanabban az útvonalban szerepelnek, akkor a kettős mutánsok fenotípusaira különböző lehetőségek lesznek a pbs2 sko1 vagy a hog1 sko1 esetekben  Ha Sko1p követi Pbs2p-t és Hog1p-t, azt várhatjuk, hogy a kettős mutáns toleráns lesz, azaz fenotípusa ugyanolyan lesz, mint a sko1 egyszeres mutánsé: a sko1 episztatikus („dominál fölötte”) pbs2-re és hog1-re (és ez is a helyzet)  Ha Sko1p megelőzi Hog1p-t és Pbs2p-t, azt várhatjuk, hogy a pbs2 sko1 és a hog1 sko1 kettős mutánsok sóra érzékenyek lesznek

62 Episztázis III  A sokkópiás szupresszió és az aktivációt okozó mutációk is az episztázis analízis hasznos eszközei  A fokozott expresszió okozta szupresszió csak olyan gén/fehérje esetében tapasztalható, amelyik a primer lézió után következik a folyamatban, mint az itt a Hog1p esetében látható; a PBS2 expresszió megnövelése nem szupresszálhatja a hog1Δ mutációt  Hasonlóképpen, egy a HOG1-et aktiváló mutáció képes szupresszálni a pbs2Δ mutánst, de a fordított eset nem lehetséges  Az episztázis koncepciót nagyon sok jelátviteli útvonal (signal transduction pathway) és celluláris rendszer analízisénél alkalmazták: ha a kettős mutáns fenotípusa hasonlít az egyik egyszeres mutánséhoz, akkor ennek génterméke a folyamat egy későbbi lépését katalizálja, azaz közelebb van a fiziológai hatáshoz X

63 Kéthibrid rendszer (two-hybrid system) Az élesztő kéthibrid rendszer két fehérje kölcsönhatásának vizsgálatára alkalmas módszer az élesztő sejtben és alkalmas arra is, hogy egy már ismert fehérjéhez keressük meg az együttműködő partnert Az eredeti változat a transzkripciós átírást használta, manapság már vannak más módszerek is. A módszer olyan hatékony, hogy nem korlátozódik csak az élesztő fehérjékre; az együttműködő partnerek bármilyen organizmusból származhatnak; néhány verzióban nincs is élesztő szekvencia A rendszer elvi alapja a transzkripciós aktivátorok modul rendszerű felépítése, amelyek kicserélhető DNS-kötő és transzkripciós aktivátor doménekből épülnek fel  Az érdekelt gént, a csalit (bait), egy DNS kötő doménhez fúzionáltatva klónozzuk, mint pl. amilyen az E. coli lexA fehérje  A potenciális kötődő partnert, a célt, vagy a prédát (prey), ami lehet könyvtár is, egy transzkripciós aktivátor doménhez fúzionáltatva klónozzuk, mint amilyen a VP16-é, ez egy vírus fehérje  A riporter gén, aminek egyetlen promótere a lexA kötőhely, csak akkor aktiválódik, ha a csali és a préda kapcsolódnak, kölcsönhatásba lépnek

64 Az élesztő kéthibrid rendszer alkalmazása Az élesztő kéthibrid rendszer alkalmazási lehetőségei hihetelenül széleskörűek Két fehérje közötti kölcsönhatást tudunk vele kimutatni A két fehérje kölcsönhatásában résztvevő domének és csoportok jellemzésére is alkalmas; ezt mutagenezissel és egy ellenszelektálható riporter gén, mint pl. az URA3 gén, felhasználásával lehet kivitelezni A kölcsönható partnerek megkeresésére is alkalmas a rendszer Két fehérje együttműködését szabályozó fehérjék izolálására Két fehérje együttműködését gátló drog screenelésre 6000 csali törzset kereszteznek 6000 préda törzzsel és genomi méretben térképezik az élesztőben együttműködő fehérjéket stb

65 Genetikai analízis: A HOG útvonal  Az ozmózist érzékelő HOG útvonal jó példa arra, hogyan is működik a genetika eszköztára  A PBS2–őt és a HOG1–et egy só érzékenység screen- nel azonosították első lépésként  SLN1 deléciója letális, ez a szenzor-hisztidin kináz az útvonal negatív szabályozója és a túl- aktiválása ártalmas  A downstream kinázokat recesszív szupresszor mutációkként azonosították  A fehérje foszfatázokat mint sokkópiás szupresszorokat találták meg  A cél géneket úgy tudták azonosítani, hogy deléciójuk különböző mértékben lehetővé tették a sin1 mutáns túlélését (vagy a gyakran használt ssk2ΔN mutánsét, amelyiknek hasonló hatása van)  Az SHO1 elágazás elemeit mint mesterséges letális ozmózis-érzékeny mutánsokként azonosították, egy ssk2 ssk22-vel kombinálva, amelyik nem érzékeny az ozmózisra  Az Rck2p és a Hog1p, valamint a Hog1p és a Hot1p fehérjék közötti kölcsönhatást kéthibrid screennel találták meg

66 A modell organizmusok A Saccharomyces cerevisiae és Schizosaccharomyces pombe élesztők elismert modell organizmusai a molekuláris biológiának, azért, mert azt remélhetjük, hogy bizonyos – de lehet, hogy a legtöbb – sejt rendszer az élesztőkben és az emberben hasonlóképpen működik, vagyis általában az eukariótákban Ez természetesen csak bizonyos mértékig igaz, de sok alapvető molekuláris mechanizmus valóban konzerválódott; bizonyos elemek más összefüggésben a speciális körülmények közötti evolúciót mutatják meg Az élesztők azért nem egyszerű humán sejtek Egy másik korlát az, hogy az élesztők egysejtűek, ezért nincs meg bennük a komplexitás magasabb szintje, azaz a soksejtű organizmusoké De jegyezzük meg, hogy vannak különböző típusú élesztő sejtek, amelyekben eltérő fehérje készlet nyilvánul meg és ezek a sejtek differenciálódását fémjelzik Bár a S. cerevisiae és a S. pombe mindkettő élesztő, különböznek egymástól, mint ahogy különböznek az embertől is S. cerevisiaeS. pombe Human

67 Modell szerep: eukarióta sejtciklus A legjobb példa, ahol az élesztő genetikai analízisével pillanthattunk be alapvető folyamatokba, az a sejtciklus szabályozása Az eukarióta sejtciklusban négy különböző fázist különböztethetünk meg: G1, S, G2 és M Továbbá, a sejtciklus folyamatában vannak döntő ellenőrzési pontok, ahol bizonyos események befejeződését ellenőrzi, mielőtt a következőt elkezdené Ezen ellenőrzési pontok relatív fontossága faj-specifikus, a S. cerevisiae esetében a START ez a kritikus pont A tápanyag hiány és a feromon okozza azt, hogy a sejtciklus ennél a pontnál lefékeződik A sarjadzó élesztő kulcs tulajdonsága, hogy a sejtciklusnak ezt az állomását a sarj mérete, a sejt morfológiája mutatja Ezt használták ki sok cdc gén sorrendjének meghatározására, aszerint, hogy a sejtciklus melyik lépését befolyásolják:: ezek a vizsgálatok alapozták meg a sejtciklus szabályozás genetikai analízisét Az aktin citoszkeleton a sejtciklusban

68 Jelátvitel (signal transduction) Az eukarióta sejtek közötti alapvető jelátviteli mechanizmusok jól konzerválódottak Például, úgy tűnik, hogy az állatokban és a gombákban a cAMP mint másodlagos jel közvetíti a tápanyag szignálokat Továbbá, minden eukarióta sejtben vannak közös jelző fehérje osztályok (signalling protein classes), mint a hormon receptorok egy típusa a G- fehérjével kapcsolt receptorok (G-protein coupled receptors); az élesztő feromon receptorai tartoznak ebbe az osztályba Egy eukarióta jelző rendszer prototípus a MAP (mitogen activated protein) kináz kaszkád; rendszerint három protein kinázból álló modulok, és ezek általában a gén expressziót szabályozzák; a modult sok, különböző stimulust érzékelő jelző útvonal tartalmazza és ezért különböző érzékelő mechanizmus szabályozza A S. cerevisiae–ben legalább hat ilyen útvonal van, amelyek együttesen szabályozzák a sejtmorfológiát, valamint a feromonra és a környezeti stresszre adott válaszokat Az élesztő genetikai analízise nagyban hozzájárult és járul ahhoz, hogy megértsük, hogyan is működnek ezek a folyamatok Természetesen vannak korlátai is a S. cerevisiae modellnek, mert pl. fontos emlős receptor osztályok, mint pl. a tirozin kinázok, vagy a sejtmag receptorok, nincsenek az élesztőben

69 Szignál transzdukció

70 Alakváltás (morpholog(y)/(cal) switch) Már említettük, hogy az élesztő sejtek meg tudják változtatni az alakjukat A váltáshoz tápanyag szignálok és egy MAP kináz útvonal kell; a cAMP-nek is van benne része Az élesztő pszeudohifa váltás (vagy a haploidok invazív növekedése) a morfogenezis egy modell rendszere A legfontosabb ebben az, hogy az alakváltás, összefüggésben van a patogenezissel (Candida albicans) és ezért alapmechanizmusait sokat vizsgálják A S. cerevisiae az alakváltást és a poliszacharid bontó enzimek ko- expresszióját használja arra, hogy behatolhasson a növény szöveteibe

71 A génexpresszió szabályozása Az eukarióta transzkripció szabályozás alapjai jól konzerváltak és sok fehérje működik más fajokban is, mint pl. a már említett transzkripciós faktorok A transzkripciót iniciáló gépezet felépítése is konzervált; sok, bár nem minden alegységnek van megfelelője az élesztőben és az emberben A transzkripció aktiválás is konzervált, de néhány aktivátor osztály (prolinban- és glutaminban- gazdag) nem működik élesztőben Bár az élesztő kromatin szerveződése sokkal egyszerűbb, néhány vonatkozásban hasonlóan vesz részt a génexpresszió szabályozásában A génexpresszió szabályozása azt jelenti, hogy a szignáloknak és a molekuláknak keresztezniük kell a sejtmag membránt és ezek a mechanizmusok úgy tűnik, hogy jól konzerváltak

72 Vezikuláris transzport (vesicular transport) A vezikuláris transzport, vagyis az a mechanizmus, amelyik a fehérjék és a membránok közlekedését szabályozza, egy másik jól konzerválódott tulajdonság az eukariótákban A hőérzékeny sec mutánsokat annak megfelelően rendezték sorba, hogy hol áll meg a transzport (elektron mikroszkóppal) és ez volt a genetikai analízis kiinduló pontja A vakuolumba történő transzportot és az endocitózist a genetikai analízis, a biokémia és a sejtbiológia módszereinek kombinálásával vizsgálták

73 Proteoszóma (proteasome) A proteoszóma egy sok alegységből felépülő, az eukariótákban konzerválódott fehérje komplex A citoplazmában és a sejtmagban is van és az ubikitinezett fehérjék lebontását szabályozza A 26S proteoszóma egy 20S katalitikus és egy 19/22S szabályozó alegységből épül fel A 20S proteoszóma 14 különböző fehérjéből áll és az összes ilyen élesztő gén már ismert A 20S élesztő komplexet tisztították és meghatározták röntgen-diffrakciós szerkezetét

74 Meglepő tulajdonságok Prionok –A kerge marha kór miatt kerültek az érdeklődés középpontjába –Az élesztőben is találtak két olyan rendszert, amelyek a prionok minden tulajdonságát mutatják! Ezek genetikai elemek, ismert gének alléljei, amelyek a nem-mendeli öröklésmenetet mutatják: a PSI + (Sup35p) fehérje a transzláció terminációban vesz részt és az URE3 (Ure2p) ami a nitrogén metabolizmus egyik szabályozója Öregedés –Ez leginkább a soksejtű organizmusokra jellemző folyamat –Az élesztő sejteknek előre meghatározott élettartama van, azaz az anyasejt néhány osztódás után elpusztul –Az öregedés folyamata az élesztőben sok hasonlóságot mutat az ember sejtjeinek öregedéséhez, mint például az rDNS gyűrűk felhalmozódása –Van egy „közös” gén is a WRN (Werner szindróma) az emberben és az SGS1 az élesztőben; a gének homológok és mutációjuk mindkét organizmusban korai öregedést okoz Sejttípus meghatározása –A korábban tárgyaltak szerint, az élesztő eltérő sejttípusokat képez, amit eltérő génexpressziós mintázat határoz meg

75 Funkcionális genomika A funkcionális genomika nincs igazán jól definiálva; napjainkban kialakuló technika, igen jól hangzó terminus technicus és sokakat arra késztet, hogy azt is átnevezzék ennek, amit már hosszú-hosszú évek óta csinálnak Ha szigorúan vesszük, akkor azt jelentheti, hogy: „a korábban még nem jellemzett, a genom szekvencia alapján azonosított gének funkciójának meghatározása” a funkcionális genomika Ez a szemlélet az élesztő esetében legalább két szisztematikus programra érvényes; ezek célja az összes, mind a 6200 ORF deléciós származékának előállítása (ez már elkészült) és ezek előzetes fenotípusos jellemzése A funkcióra más módon is következtethetünk; pl. az élesztő kéthibrid rendszerrel a teljes fehérje kölcsönhatás térképet készítik Transzpozon mutagenezissel jelölik (tagging) a fehérjéket, hogy meghatározzák sejten belüli elhelyezkedésüket A működésre vonatkozó információk nyerhetők az expressziós analízisből is (transzkriptomika) A megjelenő fehérjéket 2D gélelektroforézissel vizsgálják, így néhány ezer különböző élesztő fehérjét tudnak elválasztani (proteomika) Mind a 6200 élesztő gén megnyilvánulásának vizsgálata elérhető közelségbe került és ez lehetővé teszi a körülményektől, vagy pedig bizonyos mutációktól függő, a transzkripcióban bekövetkező változások részletes megismerését

76 Transzkripciós profil (transzkriptomika) Az élesztő transzkripciós profilezése realitás és számos, ezt a technikát alkalmazó cikk jelent már meg Az erre vonatkozó adatbázis a Stanford Egyetemen van Egy másik, nagy kollekciót Rick Young laborjában készítettek el

77 A funkcionális genomikától a rendszer biológiájáig (systems biology) A rendszerbiológia egy lépéssel tovább megy, mint a funkció analízis: a rendszerbiológia célja, hogy leírja az egész sejt működését az összes fehérjéjével együtt Egy szűkebb definíció szerint, a rendszerbiológia egyesíti a matematikai és a kísérletes megközelítéseket a biológiai hálózatok és rendszerek jobb megértése érdekében A rendszerbiológia multidiszciplináris szemléletmódja biológusok, mérnökök és matematikusok részvételét igényli A rendszerbiológián belül két irány van: (1) leírni a sejt összes fehérjéjét összekötő hálózatot és (2) leírni a sejt dinamikus működését Az összekötő hálózat rekonstrukciójához felhasználják az összes rendelkezésre álló adatot, hogy összeköthessék egymással a fehérjéket: genetikai tulajdonságok, génexpresszió, fehérje interakció A dinamikus modellezés és kísérletezés arra irányul, hogy leírja a fő szabályait annak, hogyan is változik a metabolizmus és a jelátvitel a szaporodás, vagy a differenciálódás közben

78 Élesztő biotechnológia: fermentációs iparok Az élesztős fermentációs ipar, beleértve a sütő-, söripart, a bor készítést és az ipari alkohol gyártást, még ma is a BioTech ipar legnagyobb/jobb üzlete Az ipari törzsekkel nehéz dolgozni, mert általában diploidok, poliploidok, vagy éppen aneuploidok; sok közülük fajok közötti hibrid A fermentációs folyamatok fejlesztésénél sok esetben az élesztő biológiája a limitáló tényező; pedig az élesztő törzsek átalakítására sok lehetőség van –Bor élesztők: malonsav→tejsav koverziós képesség (malolactic fermentation), amit normál körülmények között a tejsav baktériumok végeznek (gyorsabb és sokkal megbízhatóbb fermentáció); a szűrést zavaró poliszacharidok bontása; az illatanyagokat glikozidos kötéssel tartalmazó szacharidok hidrolízise (gyümölcsös illat); a versengő baktériumok és élesztők elpusztításának képessége (tisztább fermentáció és jobb bor íz); ozmózis és alkohol tolerancia; jobb termelékenység és kevesebb melléktermék tárolás közben –Sörélesztő: poliszacharid bontó képesség ( jobb szűrhetőség és kisebb kalória tartalmú sör); csökkentett acetoin és butándiol termelés (érési idő csökkenése); jobb ozmotolerancia (nagy sűrűségű erjesztés → kisebb térfogat) –Szesz élesztő: jobb alkohol hozam (kevesebb glicerin) és tolerancia –Sütő élesztő: többféle cukor felhasználás egyszerre a katabolit represszió csökkentésével (jobb kovászosodás); fagyasztás tűrés a megkezdett fermentáció után (fagyasztott tészta); nagy ozmotolerancia (nagy cukor tartalmú tészta) Az élelmiszeriparban megkísérlik a klasszikus genetikai (már ahol lehetséges) és a rekombináns DNS technikák párhuzamos alkalmazását; a közvélemény miatt eddig még nem alkalmazzák a génsebészeti beavatkozásokkal készült törzseket az élelmiszeriparban

79 Heterológ expresszió (heterologous expression) Adott fehérje termelése bizonyos célokra: –Kutatásra: tisztítás és szerkezeti analízis –Iparban: enzimek termelése az élelmiszer- és a papíriparnak, vagy kutatásra és diagnosztikai feladatokra –Gyógyszeripar: vakcina, nem glikozilált fehérjék Sokféle expressziós gazda van: baktériumok, élesztők Az élesztők előnye, hogy meg tudják csinálni a fehérjék azonos (vagy nem) poszttranszlációs módosítását, mint pl. a glikozilezés (fajtánként változó) Az élesztőben általában kisebb mértékű termelés érhető el: több mint 50% az E. coli rendszerben és az összes sejtfehérje nem több, mint %-a a legjobb élesztő rendszerekben Jelenleg a legtermelékenyebb ismert élesztő faj a Pichia pastoris, ez katabolizálja a metanolt és az egyik alkoholoxidáz génjének (AOX1) promótere igen erős és metanollal indukálható A S. cerevisiae –ben általában a glikolitikus enzimeket kódoló gének promótereit használják, mint pl. a PGK1 és a TPI1, vagy pedig szabályozható promótert, mint a GAL1 –é A S. cerevisiae előnye, hogy molekuláris biológiája jól ismert és ezért jó genetikai screen alakítható ki a fehérje termelés növelésére és a termék kiválasztására

80 Heterológ expresszió élesztőben: gén klónozás és funkcionális analízis Az élesztő heterológ expressziót felhasználhatjuk más fajokból való funkcionális gén klónozásra Egész sok emlős és növény gént klónoztak az élesztő mutánsok komplementációjával Ehhez általában egy cDNS könyvtárat klónoznak egy élesztő expressziós vektorba, ahol a cDNS megnyilvánulását egy erős élesztő promóter biztosítja (pl. PGK1) és ezt a könyvtárat használják az élesztő mutánsok komplementációjára Különösen sikeres volt ez az eljárás növényi cDNS-sel, számos transzport és metabolikus gént klónoztak így

81 Heterológ expresszió élesztőben: egyhibrid rendszer (one-hybrid system) Az élesztő egyhibrid rendszer alapjában véve egy fél kéthibrid rendszer Egy transzkripciós faktor génjének klónozásához egy olyan cDNS könyvtárat készítünk, amelyikben egy élesztő transzkripciós aktivációs doménhez vannak kapcsolva a klónozott gének és expresszálódnak élesztőben Riporter rendszerként egy olyan hibrid gént használunk, amelyikben a kérdéses emlős, vagy növény promóter fragmentuma van Ha a fúziós fehérjében van olyan DNS kötő domén, amelyik felismeri a heterológ promóter fragmentumot, akkor a riporter gén aktiválódik

82 Heterológ expresszió élesztőben : drog screening Az élesztőt könnyen és jól szaporíthatjuk még mikrotitráló lemezekben is Ez és a rekombináns DNS technikák és a heterológ expresszió alkalmazási lehetőségei miatt az élesztő jó alany arra, hogy nagy teljesítményű drog screenelést lehessen vele végezni A humán drog célpontok egyik igen fontos osztálya a G-fehérével kapcsolt receptoroké (GPCR) Az élesztő párosodási feromon válaszát is ilyen receptor szabályozza, a feromon receptorok GPCR-ek Az útvonalat úgy alakították át, hogy humán GPCR szabályozza az útvonalat és, hogy az útvonal szabályozza a riporter gén megnyilvánulását Ezt használták(ják) humán hormon agonista és antagonista vegyületek szűrésére, ezzel segítve a drogok tervezését Az élesztőt használhatjuk első közelítésben a másodlagos, vagy mellék hatások tesztelésére is, lásd transzkriptomika


Letölteni ppt "ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA A Saccharomyces cerevisiae élesztő: a természetben és alkalmazásai Más élesztők Az élesztő eukarióta: az élesztő."

Hasonló előadás


Google Hirdetések