Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Bioszenzorok Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat kiselőadás Kállai Brigitta 2014. április 22. 1.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Bioszenzorok Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat kiselőadás Kállai Brigitta 2014. április 22. 1."— Előadás másolata:

1 Bioszenzorok Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat kiselőadás Kállai Brigitta április 22. 1

2 Bioszenzorok Szenzorokkal mérhető és szabályozható paraméterek: oldott oxigén és szén-dioxid, pH, redoxpotenciál, hőmérséklet, habszint, keverés. Első fejlesztések: Biomassza meghatározása in situ optikai denzitás méréssel; Fejlődő gáz analízis; Illékony komponensek detektálása (pl. metanol). Bioszenzorok: Nem illékony szubsztrátok és metabolitok mérése; Egyetlen analitikum mérése még komplex mátrixokban is. 2

3 Bioszenzorok A mintavétel és analízis között eltelt idő összhangban kell legyen a folyamat idejével Baktériumok tenyésztése során pár perc, Lassabban szaporodó emlős sejtek esetében 1-2 óra, Immobilizált enzimet alkalmazó reaktor esetében pár másodperc. Alkalmazás: In situ (sterilizálás probléma); Szűrést követően (analízis körülményei nem egyeznek meg a fermentáció körülményeivel); Alternatíva: automata analizátorok (FIA, flow injection analysis) 3 ElőnyökHátrányok Kisebb befertőződési veszélyMembrán eltömődhet Rövid válaszidőMinta hígítására szükség lehet Kis mintatérfogat elégségespH beállítása analízis előtt Automatikus kalibrációIdővel szenzor inaktiváció

4 Bioszenzorok általános felépítése 4 Külső membrán pl. dialízis membrán Jelátalakító (Transzducer) Biológiai érzékelő (Biokatalizátor) Potenciometriás Amperometriás (Konduktometriás) Termikus Optikai Teljes organizmusok Szövetek Sejtek Organellumok Enzimek Antitestek S P JEL Jelerősítés PC Jel: pH-változás, Felszabaduló gáz, Fényemisszió Tömegváltozás Stb.

5 Enzimek alkalmazása analitikai célra (BIM) Szubsztrát, mint analitikum 5 Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (98. oldal)

6 Enzimek alkalmazása analitikai célra (BIM) Ha nincs közvetlenül mérhető változás: indikátorreakció! 6 elnyelési max. Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (98. oldal)

7 Enzimek  Kvantitatív:  Specifikus reakciók;  Minimális mintaelőkészítés;  Michaelis-Menten kinetika  Szilárd felszínen történő rögzítés (immobilizációs stratégia)  Cél:  Az enzim lehető legmagasabb aktivitása  Hosszú stabilitási idő  Rögzítést követően kis távolság a jelátviteli egységtől  Fizikai: gélbe zárás, adszorpció  Kémiai: kovalens kötéssel, keresztkötéssel, immobilizáció polimer filmbe 7

8 Fizikai: gélbe zárás  Gélképző polimerek pl. alginát, kitozán, akrilamid  Enzimtartalmú oldat + nátrium-alginát összekeverése  Csepegtetés Ca 2+ ionokat tartalmazó pufferbe  Kálcium-alginát nem oldódik vízben, a golyócskák bezárva tartalmazzák az enzimmolekulákat.  Előny: bármilyen enzimre alkalmazható  Hátrány:  Frissen kell elkészíteni  Lassú a szubsztrát/termék transzport, hosszú a reakcióidő  Enzimek folyamatosan elvesznek (póruseloszlás miatt), csökken az enzimaktivitás  Polimer szerkezete megváltozik (zsugorodhat/duzzadhat a környezet ionerősségétől függően) 8

9 Fizikai: adszorpció 9 Mi a probléma? A modell nem veszi figyelembe a parciális telítettséget, ekkor a deszorpció kedvezményezett. Alkalmazás: egyszer használatos szenzorok (nem igényelnek hosszú távú stabilitást) Előny: nincs szükség további reagensekre, minimális aktiváció Hátrány: gyenge kölcsönhatások → érzékeny a környezezet megváltozására (pH, hőmérséklet, ionerősség, polaritás) Modell: minden egyes a felülettel érintkező molekula adszorbeálodik és koncentráció gradiens alakul ki.

10 Kémiai: kovalens kötéssel immobilizált enzim  Előny: irreverzibilis (stabil)  Kémiai kötés - a fehérje funkcióit nem befolyásoló aminosav oldalláncokkal (karboxil, hidroxil, tiol, imidazol, fenol) I. Fémelektródokhoz 1)elektródfelület aktivációja: Fém + szilán → stabil –M-O-Si- kötés 2)enzim kötődése az aktivált elektród felülethez → amid kötés Aktivált enzim (BIM) 10

11 Kémiai: kovalens kötéssel immobilizált enzim II. Szénelektródokhoz 1.Felületi hidroxil csoport + cianur-klorid (2,4,6-Triklór-1,3,5-triazin) → szerves oldószerekben és vizes oldatokban stabil éter-kötés 2.Cianur-klorid + hidroxil, amino csoport Pl. torma peroxidáz rögzítése grafit részecskék felületéhez 11

12 Kémiai: keresztkötéssel 12

13 Kémiai: immobilizáció elektrokémiai polimerizációval 13 Monomer (pirrol, tiofén) → gyök → polimer In situ polimer film elektrokémiai iniciációval A vizes oldatban jelenlévő enzimmolekulák bezáródnak a növekvő polimer mátrixba Előny: Rugalmas módszer, könnyen kontrollálható Egyszerűen megvalósítható Magas enzimaktivitás Akár több réteg is növeszthető, több enzim immobilizálható Elektród felületéhez lokalizálódó polimerek: polianilin, polifenolok, polipiridin

14 Bioszenzorok általános felépítése 14 Külső membrán pl. dialízis membrán Jelátalakító (Transzducer) Biológiai érzékelő (Biokatalizátor) Potenciometriás Amperometriás (Konduktometriás) Termikus Optikai Teljes organizmusok Szövetek Sejtek Organellumok Enzimek Antitestek S P JEL Jelerősítés PC Jel: pH-változás, Felszabaduló gáz, Fényemisszió Tömegváltozás Stb.

15 Jelátalakító: potenciometriás Azt a potenciálkülönbséget méri, mely fellép az ion-szelektív membrán két oldalán. Egy ion-szelektív elektródra mindig érvényes összefüggés: 15 E – mért potenciál R – egyetemes gázállandó T – abszolút hőmérséklet n – ion töltése a i – adott ion aktivitása Ionszelektív elektród kalibrációs egyenesének meredeksége standard hőmérsékleten és nyomáson: 59/n mV Például: karbamid detektálásához ureáz enzim Ionszelektív elektród: pH, NH 3, CO 2

16 Jelátalakító: potenciometrikus enzimelektród felépítése Mérőelektród: pH-üvegelektród Üveggömbre felhordva a gélben rögzített enzim Enzimes reakció sztöchiometrikus protonképződéssel vagy NH 3 felszabadulással jár (segédelektród) 16 Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (100. oldal)

17 Jelátalakító: amperometriás Azt az áramot méri, ami az elektródon fellép egy adott potenciálon. Ez a mért áram egyenes arányban áll a kérdéses anyag oldatbeli koncentrációjával. Enzimes redox reakció: Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH 2 -oxidáz a)Első generációs: A termék keletkezésének vagy a reakciópartner fogyásának figyelemmel követésével következtetünk a vizsgálandó anyag koncentrációjára. Biokatalizátor: FADH 2 -oxidáz + O 2 → FAD-oxidáz + H 2 O 2 Elektród: H 2 O 2 → O 2 + 2H + + 2e - 17 Biokatalizátor

18 Jelátalakító: amperometriás Enzimes redox reakció: Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH 2 -oxidáz Mi a probléma? Oxigén tenziójának helyi ingadozásai (pH, hőmérséklet, ionerősség megváltozása miatt) Endogén anyagok nem-specifikus oxidációja miatti hidrogén-peroxid mérés Megoldás: mediátorok alkalmazása 18 Biokatalizátor

19 Jelátalakító: elektronátadó sók Elektronátmenettel járó enzimes reakciók (NAD, FAD mediált reakciók): elektronátadó sók 19 Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (101. oldal)

20 Jelátalakító: amperometriás Enzimes redox reakció: Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH 2 -oxidáz b) Második generációs: Mediátorral módosított, a mediátor redox tulajdonságai segítik az elektrontranszfert az enzim és az elektród felülete között. Biokatalizátor: FADH 2 -oxidáz + 2 Ferrocénium + → FAD-oxidáz + 2 Ferrocén + 2H + Elektród: 2 Ferrocén → 2 Ferrocénium + + 2e - A reakcióban felszabaduló elektronok ferrocén közvetítésével jutnak az elektródhoz. 20 Biokatalizátor

21 Jelátalakító: amperometriás Enzimes redox reakció: Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH 2 -oxidáz b) Harmadik generációs: Direkt enzim-elektród kapcsolat, az elektród közvetlenül felhasználja a reakcióban felszabaduló elektronokat. Biokatalizátor/elektród: FADH 2 -oxidáz → FAD-oxidáz + 2H + + 2e - 21 Biokatalizátor

22 Jelátalakító: amperometriás – glükóz elektród Oldott oxigént mérő elektród membránfelületére rögzített glükózoxidáz és kataláz enzim Membrán határolja, mely a meghatározandó szubsztrátra (glükózra), és a termékre (glükonsavra) is áteresztő Reakció során csökken a gélben az oldott oxigén koncentrációja, amit az oxigénelektród detektál. 22 Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (100. oldal)

23 Jelátalakító: termikus Az enzim által katalizált kémiai reakció hőenergia változását követik (exoterm reakciók, kJ/mol) A modern termisztorok 0,0001°C különbséget is képesek rögzíteni Hátránya: Nem-specifikus hőhatások miatt a szubsztrát koncentráció túlbecslése (pl. áramlásból adódó). A mérőeszköz felmelegedéséből származó hőveszteség. 23

24 Jelátalakító: optikai A biokatalitikus kölcsönhatás során UV-VIS abszorpció, bio- és kemilumineszcencia, fluoreszcencia, foszforeszcencia, visszaverődés, szóródás, stb. történik. Optikai szálak és lézerek fejlődésével nagyobb figyelmet kaptak Előnyei az elektrokémiai szenzorokkal szemben: Nincs szükség referencia elektródra; Nincs szükség közvetlen kapcsolatra a biokatalizátor és az optikai szál között; Biztonságosabbak; Stabilabbak működési szempontból. 24

25 Jelátalakító: optikai Scheper et al. (1994): BIOOPTROD Glükóz, fruktóz, glükonolakton és szorbit Glükóz-fruktóz oxidáz komplex (Zymomonas mobilis) NADP+/NADPH koenzim redukcióját/oxidációját 450 nm-en történő fluoreszcencia detektálásával vizsgálták (gerjesztés 360 nm) Pl. fruktóz redukálódik szorbittá, NADP+ lesz, fluoreszcencia csökken 25 Az optikai szál egyik végén rögzített szelektív biokomponens, a szál másik végén gerjesztő és érzékelő egység együttese

26 Jelátalakító: optikai Huang et al. (1991): kemilumineszcencia FIA, on-line glükóz, állati sejttenyészet Immobilizált glükóz oxidáz (GOD): Glükóz + O 2 + H 2 O → Glükonsav + H 2 O 2 Hidrogén-peroxid + luminol → 425 nm-en fényemisszió 26

27 Köszönöm a figyelmet! 27


Letölteni ppt "Bioszenzorok Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat kiselőadás Kállai Brigitta 2014. április 22. 1."

Hasonló előadás


Google Hirdetések