Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Élelmiszerallergének analitikája Készítette: Pipoly Erika Szabó Orsolya Erzsébet Konzulens:Bugyi Zsuzsanna 1 Korszerű élelmiszervizsgálati módszerek, 2009.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Élelmiszerallergének analitikája Készítette: Pipoly Erika Szabó Orsolya Erzsébet Konzulens:Bugyi Zsuzsanna 1 Korszerű élelmiszervizsgálati módszerek, 2009."— Előadás másolata:

1 Élelmiszerallergének analitikája Készítette: Pipoly Erika Szabó Orsolya Erzsébet Konzulens:Bugyi Zsuzsanna 1 Korszerű élelmiszervizsgálati módszerek,

2 Miről is lesz szó? általános bevezető élelmiszerallergia vizsgálati módszerek -Immunanalitikai eljárások: Western blot, RIA, RIE, ELISA, gyors módszerek -DNS alapú technika: PCR -bioszenzor (pl. SPR) összefoglalás 2

3 Elméleti bevezető 3

4 Allergia Immunrendszer kóros működése ártalmatlan idegen anyagra kórosan túlzó reakció Autoimmunitás: immunrendszer megtámadja a szervezet saját szöveteit. 4

5 Szövetkárosító immunreakciók fajtái: azonnali típusú allergiás reakció (anaphylaxia) gátló/serkentő antitest okozta reakciók immunkomplexek által létrehozott szövetkárosítás késői típusú túlérzékenységi reakció 5

6 Az allergiás betegség kialakulását befolyásoló tényezők 6 Környezeti ártalmak Allergének Veleszületett hajlam A szervezet aktuális állapota Pszichoszociális tényezők

7 A tüneteket kiváltó tényezők : fizikai hatások: hőmérséklet, páratartalom, napfény, nyomás és a fizikai terhelés, vakarás kémiai allergének: fémek, kozmetikumok, tisztítószerek, gyógyszerek, és élelmiszer adalékanyagok biológiai allergének: élelmiszer alkotórészek, pollenek, atkák, állati szőr(tollazat), penészgombák spórái 7

8 Élelmiszerallergia csecsemő-,kisgyermekkor– éretlen immunrendszer IgE antitest az allergénhez kapcsolódva váltja ki az allergiás reakciót(ételre irányuló allergiás válaszért felelős). Étkezés után jelentkezik! bármelyik élelmiszer okozhatja (allergének küszöbértéke) 8

9 Élelmiszerallergia és a fehérjeszerkezet immunogenitás keresztreaktivitás allergia szempontjából fontos: aminosavszekvencia, fehérjeláncok térbeli elhelyezkedése, a felületi szerkezet epitóp szerkezet 9

10 Keresztreakciók Gyümölcsök, zöldségek  nyír-, éger-,szilfa, mogyoró (ritkán fűfélék, fekete üröm) Fűszerek  fekete üröm, fűfélék Pollent tartalmazó ital! pl. kamilla tea, méz Egzotikus gyümölcsök! pl. nyaraláskor Főzés után enyhébbek az élelmiszer-pollen keresztreakciók. 10

11 A jelölés jogi szabályozásának célja  a fogyasztó védelme  az ember számára a lehető legmagasabb szintű életminőség megteremtése  az élelmiszer biztonsága  a versenytisztaság  az áruk szabad áramlása 11

12 Jelölni kell: Tej és tejtermékek Glutént tartalmazó gabonafélék-, Rákfélék-, Tojás-, Halak-, Földimogyoró-, Szója és a belőle készült termékek 12

13 Jelölni kell: Diófélék-, Zeller-, Mustár -, Szezámmag-, Csillagfürt-, Puhatestűek és a belőlük készült termékek Kén-dioxid és szulfitok (10 mg/kg, 10 mg/l felett) 13

14 A listán nem szereplő anyagok Aszpartám Mono-nátrium- glutamát Benzoesav és származékai Azoszínezékek csoportjába tartozó élelmiszerszínezékek Antioxidánsok ( E320,E321,E-311 ) Sűrítő anyagok ( E413 ) Kókuszdió Kivi Fenyőmag Rizs (főleg Kínában) 14

15 Ételallergia -immunrendszer kóros válaszreakciója - azonnali tünetek Étel-intolerancia -komponens irritáló v emészthetetlen pl. laktóz-intolerancia -tünetek dózis-függőek 15

16 Vizsgálati módszerek 16

17 Összefoglalás Immunanalitika (Western blot, RIA, ELISA, ELISA-PCR) Gyorsmódszerek (LFD, kit, dipsticks) DNS elválasztás PCR-rel Kromatográfiás módszerek (ioncserélő-, méretkizárásos-,adszorpciós kromatogr., RP-HPLC, LC-MS) Egyéb: Bioszenzorok pl. felületi plazmon rezonancia 17

18 Immunanalitika 18

19 1. Western blot 19

20 Western blot molekuláris biológiai módszer biomolekulák komplexében lévő fehérje kimutatására Lépései: 1.gélelektroforézis 2.blottolás (transzfer) 3.blokkolás 4.megjelölés 5.detektálás 20

21 Gélelektroforézis ált. SDS-PAGE, a mintában található fehérjék elválasztása molekulaméretük alapján 2D elektroforézis: izoelektromos pont molekulaméret 21

22 Blottolás (transzfer) az elválasztott fehérjék átvitele a gélről nitrocellulóz vagy polivinilidén membránra membránon nem specifikus fehérje kötő részek hidrofób kölcsönhatás + elektromos hatások 22

23 Blokkolás nem specifikus kölcsönhatások megakadályozása a membrán és az antitest fehérjék között kivitelezés: a membránt szérumalbumin, nem zsíros, száraz tejpor, ill. detergensek oldatába helyezik 23

24 Megjelölés 2 lépés -primer antitest: a keresett fehérjét felismeri, membránon inkubálják -másodlagos antitest: a nem kötődött primer antitestek lemosása után, elsődleges antitesthez köt, inkubáljuk -általában enzimmel jelölt (pl. peroxidáz) 24

25 Detektálás A nem kötődött antitestek lemosása után. Kolorimetrikus Kemilumineszcencia Radioaktív Fluoreszcens 25

26 26

27 27

28 2. Radioimmunoassay (RIA) 28

29 RIA immunoassay: -a keresett fehérje (= antigén) – specifikus antitest komplex -antitest rögzített, pl. PVC lemezre -antigén egy eltérő specifikus helyéhez második antitest köt (radioaktívan v enzimesen jelölt) -ELISA, Western blot, RIA, stb. 29

30 Az antigén radioaktívan megjelölt formája leszorítja a nem jelölt antigént az ellenanyaggal képzett komplexumából, a jelölés helycseréje kvantitatívan mérhető. Kompetitív gátlás. 30

31 31

32 RIA kalibráció 32

33 3. Rocket immunoelektroforézis 33

34 Immunoelektroforézis: gélközegben történő elektroforézis és immunodiffúzió kombinálása Rocket immunoelektroforézis: Az antigén az antiszérumot tartalmazó gélközegben elektromos erőtér hatására diffundál. Két reagens találkozásakor a precipitációs ív egy rakéta körvonalaihoz hasonló. Az antigén koncentráció a terület nagyságával arányos. 34

35 4. ELISA technikák 35

36 ELISA módszerek (Enzym-linked-immuno-sorbent-assay) 36

37 Röviden a módszerekről kvalitatív elemző eljárás (kvantitatív is lehet) Spec. antitestet/antigént kötünk a mikrotiter- lemezen  mosás enzimjelölt szekunder antitest/antigén hozzáadása  +szubsztrát  színreakció (Torma-peroxidáz, alkalikus foszfatáz) 37

38 Kompetitív ELISA Példa…??? 38

39 Kalibráció 39

40 Sandwich ELISA Példa…?? 40

41 Kalibráció 41

42 ELISA felhasználási példák Allergénspecifikus IgE antitestek mérése vérben Sandwich: mogyoró, mandula, dió, tojás, gliadin Kompetitív: pl. tejallergének Sajtok, halak, rizspuding, majonéz, spagetti, kenyerek… 42

43 ELISA termékek Piaci áttekintés 43

44 Mandula, tojás, tejallergének, gliadin, mogyoró, szója 3 féle kit-csomag: – Alert (5 ppm, 30 perc, S-ELISA, 20 minta/kit) – Veratox (2,5-25 ppm, 30 perc, S-ELISA, 38 minta) – Lateral flow kits 44

45 45 mandula, β -lactoglobulin, kazein, tojás, gliadin, szezámmag, mustármag, földimogyoró, szója, csillagfürt Vizsgálati idő ált perc Standard sor: Kit Controls 0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 ppm

46 Néhány példa: csillagfürt: ELISA, RT-PCR kazein: ELISA gliadin: ELISA, RT-PCR, lateral flow test földimogyoró: ELISA, RT-PCR, lateral flow test mandula: ELISA, RT-PCR Tojás, szója, zeller, dió, szezámmag, mustármag, hal, β -lactoglobulin, hisztamin,puhatestűek 46

47 mandula, csillaghal, glutén, földi mogyoró, kazein, mogyoró, tojás, szója Biokits Rapid 3-D TM ELISA kitek DNS extrakciós kitek 47

48 Tepnel biokitek előnyei Egyszerű, megbízható Gyors Egyszerű használat RAPID 3-D technológia Élelm. mátrix széles skálájára alkalmazhatóak Alacsony szintű allergén kimutatás Azonnali döntéshozáshoz Cseppent és tesztel Innovatív Rugalmas 48

49 DNS kimutatás 49

50 DNS minták elválasztása: PCR dsDNS, hőtűrő enzimek denaturáció, spec. primerek betapadása, lánchosszabbítás 50

51 Publikált PCR módszerek 51

52 Mire kell figyelni? mátrix  primerek keresztreakciói! nagyon érzékeny assay kell a multikópiás gének esetén, pl. búza, árpa, rozs nem kell az allergént kódoló gént kimutatni, elég egy allergénre spec. tulajdonság kontamináció elkerülése precíz primer, probe tervezés 52

53 Alkalmazások mogyoró, földimogyoró nyomok 10 mg/kg kimutatási határ húshamisítás szójabab lisztérzékenység gluténmentes ételek: búza, árpa, rozs  kompetitív PCR 53

54 PCR detektálása ELISA agaróz gélelfo helyett 54 Számos metódus pl. földimogyoró:  biotinilált PCR termék felvitele a streptavidinnel bevont mikrotiter lemezre

55 Detektálás menete felülethez kötött denaturált PCR termék + enzimjelölt antitesthez kapcsolt, termékre specifikus probe + kromogén szubsztrát mikroplate-reader 55

56 56

57 ELISA detektálás előny-hátrány 57 Csak kvalitatív elemzésre jó! Agaróz gélelfohoz képest jóval több minta detektálható Nem kell mérgező vegyszer Nagy a kontamináció veszélye az utómunkák során.

58 Gyorsmódszerek 58

59 Gyorsmódszerek fontossága Előnyök: Gyors eredmény Olcsó Nagy mintaszám vizsgálható Hátrányok: Pontatlanság Precizitás nem megfelelő Kinek mi a fontosabb?? 59

60 Lateral flow device Az ELISA-val ellentétben az 1 lépéses tesztcsíkon a reakciók szimultán játszódnak le, rendkívül gyorsan. Földimogyoró kimutatás:0,01%!! nyúl anti-conarachin IgG biotinilált nyúl anti-conarachin IgG avidin-torma-peroxidáz kombinációval. 60

61 LFD (lateral flow device) 61

62 LFD (lateral flow device) Felépítése mintaszűrő (papírszerű, szűr, puffereli a mintát) konjugátum pad (üvegfonálszerű, arany-, latex-, szénkonjugált oldatokban  A konjugátum mérete nm  növeli az érzékenységét) membrán (nylon, nitrocellulóz) adszorpciós pad (megköti a folyadékot  a minta továbbfolyik, át a membránon) tesztcsík, és kontroll csík (precízen, membránra rögzített antitest rétegek) 62

63 Mintafuttatás a minta átfut a mintaszűrőn és a konjugátum padon Konjugátum: a jelölt, analitra specifikus antitest (Au, latex, szén) Analit-konjugátum komplex  át a membránon a teszt zónába a teszt zóna: az immobilizált azonos epitópú antitestet  megköti a komplexeket a kontroll zóna: a membrán végén (anti-konjugátum antitestek) Szemikvantitatív  CCD kamerákkal 63

64 A gyorsteszt felépítése 64

65 Assay fajták 65

66 Egy példa 66 Biomedal cég kompetitív ELISA tesztcsíkja

67 Bioszenzorok 67

68 Bioszenzorok 68

69 2 kulcselem: -szenzor -vizsgálandó mintát áramoltató mikroberendezés szenzor: üvegfelületre felvitt vékony fémlemez (ált. arany), felületén az adott allergént megkötő ágens felületi plazmonok: fém – dielektrikum határfelületen egy speciális fénysugárral hullámszerű mozgásra kényszerített elektronok 69 SPR (Surface Plasmon Resonance)

70 70

71 Rezonancia feltétele -a gerjesztő fény impulzusának felülettel párhuzamos komponense meg kell egyezzen az azonos energiájú felületi plazmon impulzusával -a gerjesztés a fény egy adott beesési szögénél történik meg és ilyenkor a fém felületről visszavert fény intenzitásában egy minimum észlelhető (abszorpció!). 71

72 Detektálás -a rezonanciának megfelelő beesési szög értéke érzékenyen függ a másik közeg (prizma) törésmutatójától -a bekötődés megváltoztatja a felülettel érintkező réteg törésmutatóját rezonancia szög eltolódás érzékeny detektálás -analitikai és kinetikai információ: rezonancia szög időbeli változása 72

73 73 1.immobilizálás 2.kötődés, immunkomplex 3.regeneráció

74 Alkalmazások szója, borsó és oldható búzafehérjék kimutatási határ: ng/ml mogyoró fehérje kimutatási határ: 0,7 µg/ml sajt, tej kazeintartalma kimutatási határ: 85 ng/ml A felhasznált antitest pl. nyúlban termeltetett IgG. 74

75 Előnyök gyors detektálás nem igényel jelölést 75 Hátrányok esetleges nem-specifikus kötődések problémákat okozhatnak

76 OWLS Optikai hullámvezető affinitás szenzor 76 immunspecifikus molekuláris rétegek érzékelése antigén-antitest --- törésmutató változása --- beesési szög változása --- rezonancia

77 QCM Kvarckristály affinitás bioszenzor 77 bekötődés --- tömegváltozás --- frekvenciaváltozás

78 Ideális bioszenzor tulajdonságok érzékenység szelektivitás egyszerű kalibráció standardak segítségével lineáris válasz széles konc.tartományban háttérzaj-korrekció beépítés hiszterézismentes dinamikus válasz biokompatibilitás önregenerálódó képesség-monitorozás 78

79 Befejezés 79

80 Egy kis kromatográfia… Másik fontos terület, erről bővebben majd Zsuzsi… ioncserélő-, méretkizárásos-,adszorpciós kromatográfia, RP-HPLC, stb. Kapcsolt technikák a jövő! Pl. LC-MS, LC-MS/MS 80

81 Egyes allergének vizsgálatára elterjedt eljárások diófélék és magvakwestern blot, ELISA, PCR tej és tejtermékekwestern blot, RIE, ELISA tojás western blot, ELISA, PCR, SPR szója, hal, puhatestűekELISA, PCR, SPR gluténwestern blot, ELISA, PCR, MS (Maldi-TOF) 81

82 A jövőről… Az élelmiszerallergia a népesség ~ 2-3%-át sújtja, de ez az érték folyamatos növekedést mutat. A felnőtteknek 1-2%-a, a gyermekeknek kb. 5-8%-a érzékeny valamilyen élelmiszerre. Az legelterjedtebb módszerek:Western blot, ELISA Fejlődés alatt áll:SPR, kromatográfiás kapcsolt technikák. A cél minél érzékenyebb és gyorsabb módszerek kifejlesztése. 82

83 Köszönjük a figyelmet! 83


Letölteni ppt "Élelmiszerallergének analitikája Készítette: Pipoly Erika Szabó Orsolya Erzsébet Konzulens:Bugyi Zsuzsanna 1 Korszerű élelmiszervizsgálati módszerek, 2009."

Hasonló előadás


Google Hirdetések