Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Aminosavak. Az aminosavak felhasználása nátrium-glutamát  ízfokozó (Delikát, Vegeta) nátrium-glutamát  ízfokozó (Delikát, Vegeta) lizin, metionin, treonin,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Aminosavak. Az aminosavak felhasználása nátrium-glutamát  ízfokozó (Delikát, Vegeta) nátrium-glutamát  ízfokozó (Delikát, Vegeta) lizin, metionin, treonin,"— Előadás másolata:

1 Aminosavak

2 Az aminosavak felhasználása nátrium-glutamát  ízfokozó (Delikát, Vegeta) nátrium-glutamát  ízfokozó (Delikát, Vegeta) lizin, metionin, treonin, triptofán  takarmány- és élelmiszerkiegészítő lizin, metionin, treonin, triptofán  takarmány- és élelmiszerkiegészítő aszparaginsav és fenilalanin  aszpartám édesítőszer aszparaginsav és fenilalanin  aszpartám édesítőszer cisztein és triptofán  antioxidáns (gyümölcslé, tejpor) cisztein és triptofán  antioxidáns (gyümölcslé, tejpor) Infúziós oldatok, gyógyszerek Infúziós oldatok, gyógyszerek

3 A növényi eredetű takarmány nem tel- jes értékű fehérje – esszenciális amino- savakból kevés van benne. A hasznosu- lást mindig a legkisebb mennyiségben jelenlévő szabja meg (limitáló szubszt- rát) A teljes értékű fehérje (halliszt, tejfe- hérje, szója) drága és kevés van belőle → a növényit kell aminosavakkal kiegé- szíteni. Táp(lálék)kiegészítés +10 kg Met: 160 kg szója, 56 kg halliszt takarítható meg +1t Lys 70 t takarmány, 12t fehérje hasznosul, ez 15-20%

4 Előállításuk Fehérje-hidrolizátumokból: cisztein, leucin, aszparaginsav, triozin, glutaminsav Fehérje-hidrolizátumokból: cisztein, leucin, aszparaginsav, triozin, glutaminsav Kémiai szintézissel: metionin, glicin, alanin, triptofán Kémiai szintézissel: metionin, glicin, alanin, triptofán (reszolválás szükséges) Biotechnológiai úton: Biotechnológiai úton: –Direkt fermentációval: vad törzs, auxotróf és regulátormutáns változatait használják pl: glutaminsav, lizin –Prekurzor addíciós eljárással: + olyan vegyület, amelyből könnyen elő tud állítani aminosavat –Enzimes, sejtes biotranszformációval: egy biokémiai lépés, főleg aszparaginsavnál használják

5 1909: nátrium-glutamát sikérből, illetve szójából (Ajinomoto, Japán) 1957: glutaminsav és nukleotidok fermentációja Corynebacterium glutamicum törzzsel (Kinoshita, Japán) 1981: a világon összesen t aminosavat állítottak elő 1998: évi 1,5 millió tonna = 1,7 milliárd USD A 17 nagy gyártó cégből 13 japán tulajdonú : az Ajinomoto a piac 60%-át uralja az utolsó pénzügyi évben nettó eladás 10 mrd USD 23 országban 121 gyár munkahely Magyarországon is: Eurolysine, Kaba, t/év Az aminosavgyártás története

6 Az aminosavgyártás megoszlása (´98) Mennyiség t/évAminosavAlkalmazott eljárásFelhasználás L-GlutaminsavFermentációÍzfokozó L-LizinFermentációTak.kiegészítő D,L-MetioninKémiai szintézisTak.kiegészítő L-AsparaginsavEnzimes konverzióAszpartám L-FenilalaninFermentációAszpartám L-ThreoninFermentációTak.kiegészítő GlicinKémiai szintézisTáp.kiegészítő, édesítőszer 3.000L-CiszteinCisztin-redukcióTápl.kiegészítő, gyógyászat 1.000L-ArgininFermentáció, extrakcióGyógyszergyártás 500L-LeucinFermentáció, extrakcióGyógyszergyártás 500L-ValinFermentáció, extrakcióGyógyszergyártás 300L-TriptofánNyugvósejtes konverzióGyógyszergyártás 300L-IzoleucinFermentációGyógyszergyártás

7 Itt is érvényes a mennyiség-ár kapcsolat

8 Anyagcsere mérnökség – metabolic engineering A primer metabolitok előállításánál a génállományt úgy változtatják meg, hogy: -A bioszintézis út elágazásait lezárják, ezáltal minden anyag a céltermék irányába áramlik (auxotróf mután- sok) -A terméket továbbalakító reakciólépéseket eliminálják. (Ha ezek létfontosságú molekulák előállítását érintik, akkor leaky (szivárgó) mutánsok, vagy tápoldatkiegé- szítés) -Felfüggesztik a túltermelést megakadályozó mechaniz- musokat (antimetabolit rezisztens mutánsok)

9 Anyagcsere mérnökség – metabolic engineering

10 A termeléshez használt mikroorganizmusok: ASTörzsGenetikai jellemzőkKihoz (g/l) C-forrás ArgBrevibacterium flavumGua -, Ta r Glükóz Ecetsav GluCorynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Arthobacter paraffineus Vad törzs> Glükóz Ecetsav n-paraffin LysCorynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Hom -, Leu -, AEC r AEC r Hom leaky, Thr Glükóz Szacharóz Ecetsav TrpCorynebacterium glutamicum Phe -, Tyr -, 5MTrp -, 6FTrp - 12Glükóz

11 A fermentáció: Nagy, levegőztetett fermentorok (pl. 450 m 3) Nagy, levegőztetett fermentorok (pl. 450 m 3) Rátáplálásos technológia Rátáplálásos technológia pH szabályozás (karbamid, ammónia) pH szabályozás (karbamid, ammónia) Steril körülmények Steril körülmények Fágok elleni védekezés Fágok elleni védekezés AS feldolgozás: izoelektromos ponton történő kicsapás, ioncserés kromatográfia, elektrodialízis, szerves oldószeres extrakció AS feldolgozás: izoelektromos ponton történő kicsapás, ioncserés kromatográfia, elektrodialízis, szerves oldószeres extrakció Tipikus fermentációs technológia

12 GLUTAMINSAV (Glu) ELŐÁLLÍTÁSA

13 A fermentációt Corynebacterium glutamicum törzzsel valósították meg először (1957) Ez egy Gram+, nem spórás, nem csillós törzs

14 BIOSZINTÉZIS A bioszintézis kulcslépése a transzaminálási reakció:  -keto-glutársav  glutaminsav Az  KGS a citrátkörben keletkezik, onnan kell elvonni. Ha sokat elveszünk, nem zárul körfolyamat – valahogyan vissza kell pótolni az elvett intermediereket – anaplerotikus utak: piruvátból oxálacetátot termelnek. Nem általános, de a Corynebacteriumoknál és a Brevibacteriumoknál működik.

15

16 A törzs biotint igényel, ugyanis ez az acetil-Co-A-karboxiláz koenzime. Másfelől a biotin koncentrációja befolyásolja a sejt citoplaz- ma-membránjának permeabilitását. Magas biotin szint mellett a termelt glutaminsav a sejtben marad és feedback inhibíció lép fel, ami lefékezi a szinté- zist. Az optimális koncentráció 2,5 – 3,5  g/l. A melaszban több a biotin, ellensúlyozni kell: - telített zsírsavak, - penicillin. A BIOTIN SZEREPE

17 A C-forrás lehet szacharóz (melasz), glükóz, ecetsav, etanol, n-paraffin A C-forrás lehet szacharóz (melasz), glükóz, ecetsav, etanol, n-paraffin N-forrás: karbamid, (ureáz enzim hasznosítja), vagy am- mónia gáz (pH szabályozáshoz). Rátáplálással kell ada- golni, mert a túl sok N elviszi a folyamatot a glutamin (Gln) termelés irányába N-forrás: karbamid, (ureáz enzim hasznosítja), vagy am- mónia gáz (pH szabályozáshoz). Rátáplálással kell ada- golni, mert a túl sok N elviszi a folyamatot a glutamin (Gln) termelés irányába pH: 7-8, T =30-35°C, t(ferm) = 72h pH: 7-8, T =30-35°C, t(ferm) = 72h Kofaktorként: Fe 2+, K +, Mn 2+ szükséges Kofaktorként: Fe 2+, K +, Mn 2+ szükséges c(biotin)=2,5-3,5 µg/l c(biotin)=2,5-3,5 µg/l Konverzió: % Konverzió: % Kétlépcsős folytonos technológiát is kidolgoztak Kétlépcsős folytonos technológiát is kidolgoztak A FERMENTÁCIÓS TECHNOLÓGIA

18 Lizin (Lys)

19 A lizin felhasználása takarmányokban A gabona alapú takarmányok feltűnő en szegények lizinben. Lizin (+Met és Trp) hozzáadásával fehérje és szénhidrát tartalmuk sok- kal jobban hasznosul. A lizin termelés nyereségessége min- dig függ a szójadara aktuális árától. Tápanyag/ takarmány Lizin (%) Kukorica0.21 Zab0.5 Árpa0.4 Búza0.6 Szója2.9 Élesztő3.4 Tejpor2.5 Húsliszt2.6

20 A lizin kétféle anyagcsereúton képződhet, mindkettő aszpa- raginsavból indul: – Diamino-pimelinsav út – Aszparagin-szemialdehid út A Corynebacterium és Brevibacterium törzsek ez utóbbi utat használják. Anyagcsere-mérnökileg a következő mutá- ciós változásokat hozták létre: Hom - illetve Hom leaky, Met -, Thr - auxotrófia, illetve AEC r és ML r regulációs mutánsok Egyes organizmusokban a lizin dekarboxilezéssel kadáverin- né alakul, de ezekből a baktériumokból ez hiányzik. Bioszintézis

21 Mutációs változások a bioszintézisben

22 C-forrás: glükóz, melasz, alternatív megoldásokban ecetsav vagy paraffin C-forrás: glükóz, melasz, alternatív megoldásokban ecetsav vagy paraffin A nitrogénforrás ammónia, ammóniumsó vagy karbamid A nitrogénforrás ammónia, ammóniumsó vagy karbamid A homoszerin, treonin és metionin kis koncentrációban jelen kell hogy legyen (szója, kukoricalekvár adagolás), de ha leaky a mutáns, akkor nem kell adagolni, ezzel is csökken az önköltség. A homoszerin, treonin és metionin kis koncentrációban jelen kell hogy legyen (szója, kukoricalekvár adagolás), de ha leaky a mutáns, akkor nem kell adagolni, ezzel is csökken az önköltség. Biotinból minimum 30  g/l szükséges (cukornádmelasz) Biotinból minimum 30  g/l szükséges (cukornádmelasz) Opt: pH= 7, T= 28°C t(ferm)= 60 óra Opt: pH= 7, T= 28°C t(ferm)= 60 óra Fermentációs technológia

23 g/l végső lizin koncentráció, a produktivitás Yp=30-40% g/l végső lizin koncentráció, a produktivitás Yp=30-40%. nagy a fertőzésveszély, ha vannak lizin-dekarboxiláz termelők - kadaverin termelődik (hullaméreg). Ilyen törzsek az Escherichia coli, Clostridi- um welchii, Aerobacter aerogenes  tetraciklin adagolásával a befertőződés veszélye csökkenthető nagy a fertőzésveszély, ha vannak lizin-dekarboxiláz termelők - kadaverin termelődik (hullaméreg). Ilyen törzsek az Escherichia coli, Clostridi- um welchii, Aerobacter aerogenes  tetraciklin adagolásával a befertőződés veszélye csökkenthető Fermentációs technológia

24 Feldolgozási technológia

25 A D,L-  -amino-  -kaprolaktám aszimmetrikus hidrolízissel L-lizinné hidrolizálható: Egy másik enzimmel – amino-laktám racemáz – a megma- radó D-kaprolaktám racemizálható, és visszavihető a folya- matba. Félszintetikus eljárás: Lizin előállítása kaprolaktámból

26 A két enzim azonos pH-n aktív, így a két lépés egy reak- torban megvalósítható. Körülmények: pH = 8-9t = 40 °C vizes közeg Körülmények: pH = 8-9t = 40 °C vizes közeg Nyugvósejt szuszpenzió Nyugvósejt szuszpenzió Mikrooganizmusok: Candida humicola + Alcaligenes faecalis, Mikrooganizmusok: Candida humicola + Alcaligenes faecalis, vagy Cryptococcus laurentii + Achromobacter obae

27 LIZIN ELŐÁLLÍTÁSA KAPROLAKTÁMBÓL Alapanyag: ciklohexén + NOCl Alapanyag: ciklohexén + NOCl Reaktor: batch, 25 óra Reaktor: batch, 25 óra Kihozatal: 99,5% Kihozatal: 99,5% Kapacitás: 4000 t/év Kapacitás: 4000 t/év Feldolgozás: kristályosítás Feldolgozás: kristályosítás

28 Aszparaginsav (Asp) előállítása Régen fermentációval, ma egylépéses biotranszfor- mációval (sejtes vagy enzimes) állítják elő.

29 75 l-es oszlopban, 8,5 pH-n és 37°C-onKonverziófok: 99% 75 l-es oszlopban, 8,5 pH-n és 37°C-onKonverziófok: 99% + MgCl 2  aktivitás, stabilitás nő + MgCl 2  aktivitás, stabilitás nő Feldolgozás: 1. savanyítás: pH: 2,8, 2. hűtés  kicsapódik Feldolgozás: 1. savanyítás: pH: 2,8, 2. hűtés  kicsapódik t 1/2 (E) = 6 hónap t 1/2 (E) = 6 hónap

30 Mesterséges édesítőszer (aszpartám) egyik összetevője Gyógyszeriparban összetevő, illetve alapanyag Az aszparaginsav felhasználása

31 SZERIN ELŐÁLLÍTÁSA A metanol-hasznosítás egyik biokémiai útja a „szerin út”, ahol a Gly-hez kapcsolódik az aktív C1 egység. A metilotró- fok között gyakori. A MeOH olcsó, a kérdés az, hogy honnan vegyük a glicint. Lehet: –szintetikusan (amino-ecetsav, nincs aszimmetria- centruma) –biokémiai úton, megfelelő anyagcseréjű törzsekkel (glioxilát termelők)

32 A SZERIN KÖRFOLYAMAT A SZERIN KÖRFOLYAMAT Glioxilát két úton is képződhet, malátból és izo-citrátból. Glioxilát két úton is képződhet, malátból és izo-citrátból. Ha a folyamatot a szerin után megállítjuk, felhalmozódást érhetünk el. Ha a folyamatot a szerin után megállítjuk, felhalmozódást érhetünk el.

33 SZERIN ELŐÁLLÍTÁSA SZERIN ELŐÁLLÍTÁSA A körfolyamat mérlege: 2 metanolból és 1 széndioxidból keletkezik egy 3-foszfo-glicerát. A glicin fehérje-alkotó aminosav, nagyobb koncentrációban mégis toxikus  toleráns mutánsokat izoláltak. Ipari eljárás: Törzs: metilotróf (pl. Pseudomonas ), Gly toleráns Törzs: metilotróf (pl. Pseudomonas ), Gly toleráns Szaporítási szakasz: pH ~ 4,5, hőmérséklet ~ 30 °C Szaporítási szakasz: pH ~ 4,5, hőmérséklet ~ 30 °C Termelési szakasz: glicin adagolás indul, a hidroxi- piruvát-reduktázt gátolják: Termelési szakasz: glicin adagolás indul, a hidroxi- piruvát-reduktázt gátolják: –Hőmérséklet emelés fokig –pH emelés 8,5 – 9,5 –ig –Co 2+ vagy Ni 2+ adagolása Végső koncentráció: g/l, konverzió ~50 % (mól/mól)

34 SZERIN ELŐÁLLÍTÁSA SZERIN ELŐÁLLÍTÁSA A szerint kinyerhetjük még melaszból is, ioncserélő gyantá- val, pH = 5,7-nél. A kapott szerin oldatot 35%-ra bepárolva a D-szerin frakció kiválik, szűréssel elválasztható, az L-szerin oldatban marad.

35 A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA Lehetőségek: De novo bioszintézis: szénhidrátokból sok lépéssel. A japánok ezt is megoldották a Corynebacterium és Brevibacterium törzsekkel, de ezek keveset termelnek. Anyagcsere-mérnökiszelekció: Phe -, Tyr -, 5-Me-Trp r

36 A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA Prekurzoros bioszintézis: indol, vagy indol+glicin adagolá- sával. Indol alapon: szerin termelő törzsek tenyészetéhez indolt adnak: metilotrófok: glicin + indol élesztők ( Candida, Hansenula ): indol Az indol nagyobb koncentrációban károsítja a sejteket, ezért folyamatos mérések alapján adagolják (0,5 – 1,0 g/l) El lehet érni az oldhatósági határt (~12 g/l)

37 A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA Biokonverzió: a szerin + indol összekapcsolása egylépéses enzimes reakció. Megvalósítható nyugvó sejtekkel, vagy izolált, esetleg im- mobilizált enzimmel.

38 A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA Ipari konverziós eljárás (Amino GmbH, D, 1988 óta) Törzs: Escherichia coli nyugvósejtes tenyészete Körülmények: pH = 8 – 9, t = 40 °C, vizes közeg, fed batch piridoxál foszfát szükséges, az indolt on-line HPLC méri

39 A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA A TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA Tartózkodási idő: 6 óra Termékkoncentráció: 12,25 g/l (telítési, a Trp kiválik és a sejtekkel együtt elválasztható) Feldolgozás: a csapadékból forró vízzel feloldják a tripto- fánt, majd elválasztják a sejtektől. Többszöri kristályosítás. Konverzió: 95 % (indolra) Éves termelés: 30 t/év A TRIPTOFÁN FELHASZÁLÁSA: aktív gyógyszerkomponens (az agyi szerotonin szintre hat, nyugtat, altat, antidepresszáns) tápanyagkiegészítő (esszenciális) intermedier

40 L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA Lehetőségek (közös szintézisút a triptofánnal): De novo bioszintézis: szénhidrátokból sok lépéssel. A japá- nok ezt is megoldották a Corynebacterium és E. coli tör- zsekkel. Anyagcsere-mérnökiszelekció: Trp -, Tyr -

41 FERMENTÁCIÓS ELŐÁLLÍTÁS Törzs: az élelmiszeriparban (édesítőszer) az E. coli nem megengedett, marad a Corynebacterium. Más célokra jó az E. coli. Törzs: az élelmiszeriparban (édesítőszer) az E. coli nem megengedett, marad a Corynebacterium. Más célokra jó az E. coli. Technológia: Technológia: –3 db 150 m3-es fermentor, –a fermentációs idő 2.5 nap –a végső fenilalanin koncentráció 20 g/l. –Kapacitás: 1000 t/év

42 L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA Biokonverzió: 1. Fenil-piroszőlősavból transzaminálással Törzsek: E. coli, Pseudomonas fluorescens Amino-donor: L-aminosavak, Glu, Asp. Az NH 4 + ion nem al- kalmas. Aktív anyag: nyugvó, vagy immobilizált sejtek.

43 L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA Biokonverzió: 2. transz-fahéjsavból addícióval Törzs: Rhodococcus rubra, Rhodotorula rubra Körülmények: mind a szaporítás, mind a konverzió szigorú- an anaerob körülmények között megy végbe, N 2 atmoszfé- rában. pH = 10,6t = 25 °C, vizes közeg, de: 15% NH 3 !! Mert különben balra tolódik az egyensúly.

44 L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA Körülmények: Adagolások: ammónium-cinnamát, a pH szabályozáshoz NH 3, illetve CO 2. Keverés: N 2 befúvatásával Phe koncentráció: 43 g/l Kihozatal: 85,7 % Feldolgozás: centrifugálás, bepárlás. Kristályosítás A FENILALANIN FELHASZNÁLÁSA: aszpartám (édesítőszer) gyártására gyógyszeripari alapanyag

45 L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA L-FENILALANIN ELŐÁLLÍTÁSA A technológiák összehason- lítása: Technológiailag (a felső két sor) a konverziós eljárások a jobbak. Gazdaságilag a fermentáció Ok: az alapanyagok ára na- gyon eltérő. Fermentá ció Prekurzoros Biokonver zió Nyersanyagglükóz fenilpiroszőlő sav transz- fahéjsav Produktivitás (g/l/h) Reakcióidő (óra) pH Hőmérséklet (°C) Sejttömeg konc. (g/l) Aminodonor-L-aminosav NH 3 Önkölség ($/kg)

46 RESZOLVÁLÁS RESZOLVÁLÁS Általánosan: a racém (DL) elegyek komponenseinek szét- választása. Azért itt tárgyaljuk, mert az aminosavaknál csak a L-forma biológiailag aktív, ezt kell előállítani, használni. Két fő út (ld. Biomérnöki alapfolyamatok): aszimmetrikus szintézis, aszimmetrikus hidrolízis Ezek közül a hidrolízissel foglalkozunk, mert az egyedüli szintetikusan előállított aminosav, a Met esetében ezt alkalmazzák. A racém aminosav keverékre olyan funkciós csoportot kö- tünk, aminek eltávolítására van sztereoszelektív enzim. Típusreakció: N-acilezés, majd hidrolízis aminoacilázzal.

47 ASZIMMETRIKUS HIDROLÍZIS ASZIMMETRIKUS HIDROLÍZIS Az aminoaciláz csak az L-aminosavakat szabadítja fel, a D- származék megmarad. Ez utóbbit lúgos főzéssel racemizál- ják, újra acilezik, és visszaviszik a folyamat elejére. Az enzimet az Aspergillus oryzae termeli, sokféleképpen im- mobilizálják (Sephadex, acetilcellulóz, gélbezárás). Racemizálás

48 ASZIMMETRIKUS HIDROLÍZIS ASZIMMETRIKUS HIDROLÍZIS A metionin reszolválása (Degussa eljárás). Körülmények: pH = 7,0t = 37 °C Co 2+ effektor Oldott enzim. Feldolgozás: az L-Met kiristályosítható, az enzimet ultraszű- réssel lehet visszanyerni. Ugyanez az eljárás alkalmazható még: Ala, Phe, Val, Leu, Trp, Tyr-ra.

49 TANABE ELJÁRÁS TANABE ELJÁRÁS Immo- bilizált enzim- mel

50 ASZIMMETRIKUS HIDROLÍZIS ASZIMMETRIKUS HIDROLÍZIS Membrános eljárás: az oldott enzimet egy ultraszűrő mem- brán tartja vissza, míg a termék szabadon áthalad. A keringetés során az enzim lassan elveszti az aktivitását a nyíró hatások miatt. Kapacitás: 200 t/év,Met, Val, Phe gyártás


Letölteni ppt "Aminosavak. Az aminosavak felhasználása nátrium-glutamát  ízfokozó (Delikát, Vegeta) nátrium-glutamát  ízfokozó (Delikát, Vegeta) lizin, metionin, treonin,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések