Génterápia A páciens sejtjeinek genetikai módosításán alapuló terápia. - klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô: <--- így.

Az előadások a következő témára: "Génterápia A páciens sejtjeinek genetikai módosításán alapuló terápia. - klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô: <--- így."— Előadás másolata:

1

2 Génterápia A páciens sejtjeinek genetikai módosításán alapuló terápia. - klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô: <--- így pótoljuk a hiányzó aktivitást, <--- szelektíven megöljük a target sejtet, mozgósítjuk az immun-rendszert. - nem-klasszikus: az adott gén expressziójának gátlása, a mutáció “kijavítása“ Csak szomatikus génterápia végezhető!

3 (27) (86)

4

5 Genetic diseases: Type 1: Egy defektív lokusz (gene), mely a betegség okozója, 100% örökletes. példa: Sickle cell anemia, Hypercholesterolemia Cystic fibrosis Type 2: Több génes, <100% örökletes, és a betegség megjelenését a környezet és az életstílus befolyásolja. példa :Heart disease Cancer Diabetes Alcoholism Schizophrenia Criminal behavior? etc….?

6 A génterápiát befolyásoló tényezők optimális kedvezőtlen Öröklődés módja recesszív domináns Mutáció funkció hiány túltermelés Tárgysejtek könnyű rossz (agy). elérhetősége ex vivó in vivó esetleg elérhetősége ex vivó in vivó esetleg A DNS mérete kicsi óriás A génexpresszió kevéssé szigorú kontrol szabályozása szabályozott szabályozása szabályozott

7 - klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô: <--- így pótoljuk a hiányzó aktivitást, <--- szelektíven megöljük a target sejtet, mozgósítjuk az immun-rendszert.

8 - klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô: így pótoljuk a hiányzó aktivitást, szelektíven megöljük a target sejtet, mozgósítjuk az immun-rendszert.

9 - nem-klasszikus: az adott gén expressziójának gátlása, a mutáció “kijavítása“

10 Ex vivó Génterápia

11

12 Gattinoni, et al, Nature Reviews in Immunology 6:383 (2006) Dramatic regression of metastatic melanoma sometimes results from adoptive transfer of expanded TIL

13 In vivó terápiás génbevitel

14 Génterápia tumorok kezelésére Vírus vektor – TNF gén sugárzás érzékeny promoter

15 Az ideális vektor jellemzői: 1.Csak a célsejtbe jusson be. 2.Nagy inzert, egy vagy több gén beépíthető. 3.Ne váltson ki immunválaszt. 4.Stabil legyen, ne mutáljon el. 5.Könnyű legyen nagy mennyiségben(titer) gyártani. 6. A hatáshoz elegendő mennyiségű fehérjét termeljen.

16 A leggyakrabban használt vektorok RetrovirusAdenovirus Adeno-Naked DNA/ associated Liposomes Insert size8kb~30kb4kbunlimited Integrationyesnorarerare Production>10 6 cfu/ml>10 11 >10 12 unlimited Administration ex vivoex/in vivoex/in vivo ex/in vivo Expressionlongtransientpot. good?Transient Express level moderatehighmoderatehigh Immunefewextensive??None Safety concerns:InsertionalInflammatoryInflammatorynone? mutagenesisresponse responsetoxic (25%) (3%)(25%) (*2006)

17 Génterápiában alkalmazott vektorok viselkedése

18 Retrovirus life cycle From: Alberts et al. Molecular Biology of the Cell

19 Retrovirus genome 5’ LTR Packaging Gene X Neo r 3’ LTR Encapsidation (packaging) Retrovirus vector construction for gene therapy

20 5’ LTR Packaging Gene X Neo r 3’ LTR Retrovirus vector packaging for gene therapy Packaging cell line express viral gag and pol Produce high titer recombinant virus in 24-72 hours. Packaging cell line (makes virus) 1. + Vector (transfection) 2.Collect virus after 24-72 hrs. 3.Concentrate virus / high titer. 4.Transduce host cell.

21 Nem virális DNS bejuttatás: 1.Cationic liposomes: Positively charged lipids interact with negatively charged DNA. (lipid-DNA complex). -Transverses cell membranes Advantages: a. Stable complex b. Can carry large sized DNA c. Can target to specific cells d. Does not induce immunological reactions. Disadvantages: a. Low transfection efficiency b. Transient expression c. Inhibited by serum d. Some cell toxicity

22 Génbevitel liposzóma segítségével

23 Nem virális DNS bejuttatás 2. Plasmid DNS injektálás cDNA Promoter + gene of interest (P) (gene X) P Gene X Megfigyelt expresszió tímusz, váz és szív izom, bőr.

24 Egy gén expressziójának csökkentése

25 - Decrease expression -Ribozyme aaaaa --------auucg--------ccguuua---- ----uaagc-- ggcaaau---- cDNA ribozyme Cleavage of the target mRNA

26 - Decrease expression -Antisense aaaaa ---------------- caaucggccccuucguuua ---- gttagccggggaagcaaat 1- Small single-strand DNA oligonucleotides (15 -25 bases) RNAse degradation of the RNA/DNA double strand molecule

27 ADA/génterápia Ashanti de Silva: az elsô páciens, aki génterápiás kezelésben részesült (1990-ben). Adenosin dezamináz-hiány (ADA) a T-sejtek mûködési zavarát idézi elô -> immunhiány. Ex vivo génterápiával a T-lifocitákat ADA cDNS-t tartalmazó retrovirussal fertôzték, majd a páciensbe visszajuttatták. Párhuzamosan enzim-szubsztituciós terápiát is alkalmaztak.

28 A génterápia első áldozata Jesse Gelsinger (18 éves)

29 Case study: Jesse Gelsinger *First documented patient to die from gene therapy treatment. (may have been others). Disease: liver enzyme deficiency (ornithine transcarbamylase, OTC) – controls ammonia metabolism Vector used to deliver OTC – modified adenovirus Goal: deliver vector to liver cells and express OTC. Problem: Very low transfer efficiency (1%), difficult to get enough functioning OTC expressed to do any good. Solution: Infect with higher dose of viral particles. (38 trillion)

30 Outcome: - Vector not only delivered gene to liver but to other tissue. -Triggered systemic inflammatory response. -Patient acquired fever, coma, death. Why? -Animal studies suggested dose was OK (?). -Adenoviral vectors known to induce inflammatory response. -Patient already compromised: Patient had higher than allowed ammonia levels.

31 Results of follow-up investigation: -3 month investigation by FDA concluded. - patient enrollment in study despite ineligibility. - participants misled on safety and toxicity issues. - loosening of criteria for accepting volunteers. - informed consent document did not reveal results of animal studies. * Other investigators may not have disclosed important information on patient deaths in gene therapy trials. Adenovirus safety: Engineered to prevent viral replication. Mutation from replication incompetent to competent? Shut down of Univ. of Penn. Institute for Human Gene Therapy Lawsuits

32 Antitestek használata vizsgálati és terápiás célokra

33 Source: CDC Vaccines have dramatically reduced infectious disease incidence Mechanism: Vaccines stimulate specific antibody production, blocking infection at an early stage

34 Chimeric mAb

35

36 99m Tc-mAb in vitro in vivo Tumor diagnosis

37 Sharkey, RM and Goldenberg, DM CA Cancer J Clin. 56::226 (2006) Enhancing antibody cytotoxicity for cancer therapy

38 Scallon BJ, et al J Immunother 29:351 (2006) Oncology Antibodies approved by the US FDA

39 Epitopes Immune Response Antibodies A mixture of antibodies - all bind to epitopes of the original antigen. Some bind with higher affinity than others. Polyclonal antibodies Protein Immunize

40 Kuby Figure 4-22

41 Antibodies can be “humanized” to avoid host immune responses

42 Chimeric mAb

43

44 FÁG DISPLAY