Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

NAGY ÁTBOCSÁTÓ KÉPESSÉGŰ ANALITIKAI MÓDSZEREK (High Throughput Analytical Methods)

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "NAGY ÁTBOCSÁTÓ KÉPESSÉGŰ ANALITIKAI MÓDSZEREK (High Throughput Analytical Methods)"— Előadás másolata:

1 NAGY ÁTBOCSÁTÓ KÉPESSÉGŰ ANALITIKAI MÓDSZEREK (High Throughput Analytical Methods)

2 MODERN GYÓGYSZERKUTATÁS GÉNTECHNOLÓGIA VALIDÁLT CÉLMOLEKULA KIVÁLASZTÁS CÉLMOLEKULA ORIENTÁLT VEZETŐMOLEKULA (LEAD) KERESÉS HTS (HIGH THROUGHPUT SCREENING) AUTOMATIZÁLÁS (ROBOTTECHNIKA) MINIATÜRIZÁLÁS BIOINFORMATIKA

3 Nagyhatékonyságú tesztelés Farmakofór modell 3D szerkezet QSAR, Neural Network Term. hat.anyagok Random könytárak Hipotézis Célzott könytárak Primér „assay” Fokuszált könyvtárak Optimization process Racionális hatóanyag tervezés Vezető molek. Virtuális „screening” Optimalizált vez. molekulák Gyógy- szer Ismert hatóanyag molekulák Farmakofór modell (Validált célmolekula)) Gyógyszerkutatási paradigma

4 A FEW "CLASSIC" REFERENCES IN COMBINATORIAL CHEMISTRY Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid," H.M. Geysen, R.H. Meloen, and S.J. Barteling, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, (1984). "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificity of antigen-antibody interactions at the level of individual amino acids," R.A. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, (1985). "General method for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures", A. Furka, F. Sebestyen, M. Asgedom, and G. Dibo, Int. J. Peptide Protein Res., 37, (1991). "A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity", K.S. Lam, S.E. Salmon, E.M. Hersh, V.J. Hruby, W.M. Kazmierski, and R.J. Knapp, Nature, 354, (1991). "Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery", R.A. Houghten, C. Pinilla, S.E. Blondelle, J.R. Appel, C.T. Dooley, and J.H. Cuervo, Nature, 354, (1991). "Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis", S. Fodor, J.L. Read, M.C. Pirrung, L. Stryer, A.T. Lu, and D. Solus, Science, 251, (1991). "Diversomers: An approach to nonpeptide, non-oligomeric chemical diversity", S. Hobbs Dewitt, J.S. Kiely, C.J. Stankovic, M.C. Schroeder, D.M.R. Cody, and M.R. Pavia, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90, (1993). "The combinatorial synthesis and chemical and biological evaluation of a 1,4- benzodiazepine library", B.A. Bunin, M.J. Plunkett, and J.A. Ellman, Proc. Natl. Acad Sci., USA, 91, (1994).

5 VEGYÜLETTÁRAK ANALITIKAI VIZSGÁLATA VEGYÜLETTÁRAK TÍPUSAI –TERMÉSZETES ANYAGOK –KOMBINÁCIÓS KÖNYVTÁRAK KEVERÉKEK (POOLS) EGYEDI ANYAGOK ANALITIKAI PROBLÉMÁK –REAKCIÓ KÖVETÉS (MONITOROZÁS) –TISZTASÁG VIZSGÁLATA (KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA) –SZERKEZET IGAZOLÁS KÖVETELMÉNYEK (MILYEN AZ IDEÁLIS MÓDSZER?) –EGYSZERÜ –GYORS –RONCSOLÁSMENTES –SZELEKTIV –ÉRZÉKENY –OLCSÓ

6 REAKCIÓ KÖVETÉSI MÓDSZEREK SZILÁRD FÁZISÚ SZINTÉZISEKNÉL (SPS) –LEHASITÁS MINDEN LÉPÉSBEN, ÉS ELLENŐRZÉS SZOKÁSOS MÓDSZEREKKEL –"ON-BEAD" ANALIZIS (GYANTÁN) : MIKROANALIZIS (RONCSOLÁSOS, HALOGÉN KÉN STB. MÉRÉSÉRE, GRAVIMETRIA) KÉMIAI (PL. KAISER -NINHIDRINES, PIKRINSAVAS ) REAKCIÓ NMR (MAGIC ANGLE SPINNING "MAS" TECHNIKA = SZILÁRD/GÉL FÁZISÚ NMR) UV SPEKTROSZKÓPIA (PL. A LEHASITOTT VÉDŐCSOPORT (FMOC= DIBENZOFULVÉN) KVANTITATIV MÉRÉSÉRE ) FT-IR, REFLEXIÓS MÉRÉS KVANTITATIV IR MIKROSZKÓPIA

7 IR MIKROSZKÓPIA PROBLÉMÁK: –GYANTASZEMCSE MÉRET ( mm) –ÉRZÉKENYSÉG –SUGÁRMENET TORZULÁS (REFRAKCIÓ A LEVEGŐ-GYANTA-LEVEGŐ HATÁRRÉTEGEN) –GYENGE SZELEKTIVITÁS A HASONLÓ FUNKCIÓS CSOPORTOKRA (PL. SAV, ÉSZTER, ALDEHID ) MEGOLDÁS –IR MIKROSZKÓP (BRUKER) –0.1 mm-es HIGANY-KADMIUM-TELLURID DETEKTOR –FOLYÉKONY NITROGÉN HÜTÉSSEL –EGY GYANTASZEMCSE KBr PASZTILLÁRA HELYEZVE –AZ IR SUGARAT A GYANTASZEMCSE KÖZEPÉRE FÓKUSZÁLJÁK –DEUTERÁLT VÉDŐCSOPORTOK (BOC) ALKALMAZÁSA NÖVELI A SZELEKTIVITÁST DEUTERÁLT REAGENSEK KAPHATÓAK A C-D REZGÉS cm-1 -NÉL ELKÜLÖNÜLTEN LÁTSZIK A SPEKTRUMBAN A POLISZTIROL GYANTA ELNYELÉSÉT KI LEHET SZÜRNI (DIFFERENCIA SPEKTRUM) HASZNÁLHATÓSÁG: –KVANTITATIV REAKCIÓ KÖVETÉS –GYANTÁRA KÖTÖTT PEPTIDEK KVANTITATIV MEGHATÁROZÁSA –MÉRÉSI IDŐ KB 1 PERC

8 MAS (MAGIC ANGLE SPINNING) NMR (TÖBBNYIRE H) GÉL FÁZISBAN TÖRTÉNIK A FELVÉTEL AZ OLDÓSZER MOZGÁSA A POLIMERBEN KINYÚJTJA A LÁNCOKAT ÉS IGY GYORSITJA A KÖTÖTT MOLEKULÁK MOZGÁSÁT A MEGNÖVEKEDETT MOLEKULÁRIS MOBILITÁS KÖVETKEZTÉBEN A SZILÁRD ANYAG SPEKTRUMÁBAN NÉHA 20 Hz-ES VONALKISZÉLESEDÉST OKOZÓ KÖLCSÖNHATÁSOK (PL. HOMONUKLEÁRIS DIPOLÁRIS ~) KIÁTLAGOLÓDNAK, IGY A VONALKISZÉLESEDÉS CSÖKKEN. A KIÁTLAGOLÓDÁS NEM TELJES A GYANTA ANIZOTRÓPIÁJA FOLYTÁN, A MARADÉK "DIPOLÁRIS" VONALSZÉLESEDÉS A MINTA "MÁGIKUS SZÖGBEN" TÖRTÉNŐ, MEGFELELŐ SEBESSÉGÜ (A NEM FORGATOTT MINTA VONALKISZÉLESEDÉSÉNÉL NAGYOBB FREKVENCIÁJÚ) FORGATÁSÁVAL ELIMINÁLHATÓ.

9 KEVERÉKEK ANALIZISE MÓDSZEREK –VRK –HPLC –MS –HPLC-MS –GC-MS –MS-MS (TANDEM) ALAPVETŐ PROBLÉMA: –20 ÚJ ANYAG ESETÉN MÁR KICSI AZ ESÉLY AZ ELVÁLASZTÁSRA –EZÉRT INKÁBB AZT CÉLOZZÁK, HOGY A TERVEZETT ANYAGOK TÖBBSÉGE BENNE VAN AZ ELEGYBEN (ES-MS) ÁLTALÁBAN MINDEN REAKCIÓLÉPÉST LEGALÁBB EGY EGYEDI MINTA VIZSGÁLATÁVAL KÖVETNEK. A REFERENCIA MINTÁT HAGYOMÁNYOS ESZKÖZÖKKEL VIZSGÁLJÁK.

10 AUTOMATIZÁLT SZINTETIKUS MÓDSZEREK STANDARDIZÁLT ELJÁRÁSOK PARALLEL MÓDSZER AUTOMATA PIPETTOROK MIKROTITER LAPOK (96 MULTIWELL), CSÖVEK

11 AUTOMATIZÁLT ANALITIKAI MÓDSZEREK AUTOMATA INJEKTOROK AUTOMATA FRAKCIÓSZEDŐK (SPLITTEREK) SZÁMITÓGÉPES VEZÉRLÉS HPLC –RÖVIDEBB OSZLOPOK (5 CM) –SPECIÁLIS DETEKTOROK (UV, MS) –ALACSONY OLDÓSZERIGÉNY –GYORSABB FUTÁS (3 PERC) –PREPARATIV ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEK TÖMEGSPEKTROMETRIA –A MOLEKULÁKAT (ATOMOKAT) TÖMEGÜK ALAPJÁN VÁLASZTJA EL –ALKALMAS ELEMEK, MOLEKULÁK, MAKROMOLEKULÁK (PROTEINEK) ANALIZISÉRE –A GRAVITÁCIÓS KÖLCSÖNHATÁS NEM ELEGENDŐ AZ ELVÁLASZTÁSHOZ -> IONIZÁLNI KELL A RÉSZECSKÉKET, ÉS IONFIZIKAI MÓDSZEREKET KELL ALKALMAZNI

12 MILYEN ADATOKAT SZOLGÁLTAT AZ MS? PONTOS RÉSZECSKE TÖMEGET FRAGMENTÁCIÓS UJJLENYOMATOT (A VEGYÜLETRE JELLEMZŐ) AMI ADATBÁZISBÓL VISSZAKERESHETŐ A KONTROLLÁLT FRAGMENTÁCIÓ (MS-MS) ÚJ VEGYÜLETEK SZERKEZETÉNEK MEGHATÁROZÁSÁRA ALKALMAS EGYES FUNKCIÓS CSOPORTOK JELLEMZŐ CSÚCSOK FORMÁJÁBAN AZONOSITHATÓAK A SPEKTRUMBAN A RELATIV IZOTÓPELŐFORDULÁSOK INFORMÁLNAK A VEGYÜLETBEN LEVŐ ELEMEKRŐL KEVERÉKEK VIZSGÁLHATÓAK KAPCSOLT TECHNIKÁKKAL (LC-MS, GC-MS) IGY ELKERÜLHETŐ AZ ELŐZETES MINTA TISZTITÁS

13 TÖRTÉNETI ELŐZMÉNYEK J.J. THOMSON (CAVENDISH LABORATORIES, 1897) A KUTATÓCSOPORT HÉT FIZIKAI ILL. KÉMIAI NOBEL DIJAT NYERT EL AZ ELSŐ HASZNÁLHATÓ KERESKEDELMI MS 1948-BEN (MS-2, MANCHESTER,UK) (KB 300 TÖMEGEGYSÉGIG MÉRT) UGYANEKKOR FEDEZTÉK FEL A TOF (TIME-OF- FLIGHT) MS TECHNIKÁT A QUADRUPOLE DETEKTORT SZABADALMAZTATTÁK

14 IONIZÁLÁSI MÓDSZEREK I. FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB) –A SZILÁRD MINTA-MÁTRIX KEVERÉKET GYORS RÉSZECSKESUGÁRRAL ÜTKÖZTETIK –A MÁTRIX KISMOLEKULÁJÚ SZERVES ANYAG (GLICERIN VAGY 3- NITROBENZIL-ALKOHOL) –A MÁTRIX SZEREPE A "FRISS FELÜLET" FENNTARTÁSA AZ ÜTKÖZTETÉSHEZ –IGY NŐ A SPEKTRÁLIS ÉLETTARTAM ÉS NŐ AZ ÉRZÉKENYSÉG –A RÉSZECSKESUGÁR ÁLTALÁBAN ARGON VAGY XENON, AZ ENERGIÁJA 4-10 KeV –AZ ÜTKÖZÉSEK KÖVETKEZTÉBEN A FELÜLETBŐL POZITIVAN ÉS NEGATIVAN TÖLTÖTT IONOK LÉPNEK KI –A KELETKEZETT IONOKAT ELVEZETVE A SPEKTROMÉTERREL ANALIZÁLJUK –AZ ELVEZETŐ ELEKTRÓD POLARITÁSA ÁTKAPCSOLHATÓ, IGY LEHETŐSÉG VAN +FAB (POZITIV ION) ANALIZISRE (NEGATIV TÖLTÉS ESETÉN) ILL. -FAB ANALIZISRE IS. –A FAB MS "SOFT" IONIZÁLÁSI TECHNIKA, IGY LEHETŐSÉG VAN KIS ILLÉKONYSÁGÚ MINTÁK MÉRÉSÉRE –A MINTÁK PSZEUDO-MOLEKULA IONOKAT SZOLGÁLTATNAK (M+H)+ ill. (M-H)- JELLEMZŐ FRAGMENS IONOK ÉS NAGYOBB TÖMEGÜ DIMEREK, ASSZOCIÁTUMOK MELLETT

15 IONIZÁLÁSI MÓDSZEREK II. ELEKTROSPRAY IONIZATION (ESI) –1930, CHAPMAN, 1960 DOLE, 1980 FENN ÉS MANN –EGYIK LEGELTERJEDTEBB MÓDSZER –TÖLTÖTT CSEPPEKET ÁLLITANAK ELŐ PL. EGY KAPILLÁRISON KERESZTÜLPRÉSELVE AZ ANYAG OLDATÁT, MELYRE MEGFELELŐ FESZÜLTSÉGET KAPCSOLNAK –A FESZÜLTSÉG HATÁSÁRA AZONOS TÖLTÉSÜ FINOM CSEPPEK KELETKEZNEK –AZ OLDÓSZER ELPÁROLOG, CSÖKKENTVE A RÉSZECSKEMÉRETET ÉS NÖVELVE A FELÜLETI TÖLTÉSKONCENTRÁCIÓT –EGY ADOTT CSEPPMÉRETNÉL (RALEIGH LIMIT) A MEGNÖVEKEDETT TÖLTÉS SZÉTROBBANTJA A CSEPPEKET,MELYBŐL APRÓ KISEBB TÖLTÉSÜ RÉSZEK KELETKEZNEK –A FOLYAMAT ADDIG FOLYTATÓDIK, MIG "CSUPASZ" IONOK KELETKEZNEK –A TÖLTÉSEK STATISZTIKUSAN ELOSZLANAK A MOLEKULA TÖLTHETŐ RÉSZEI KÖZÖTT, MEGFELELŐ KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT TÖBBSZÖRÖS TÖLTÉSÜ IONOKAT HOZVA LÉTRE. –SZÁRITÓ GÁZT VEZETVE A FOLYADÉKÁRAMBA ILL. NÖVELVE AZ ÁRAMLÁSI SEBESSÉGET, NŐ A TÖBBSZÖRÖS TÖLTÉSÜ IONOK SZÁMA –CSÖKKENTVE A KAPILLÁRISÁTMÉRŐT, CSÖKKENTVE AZ ÁRAMLÁSI SEBESSÉGET = NANOSPRAY ("SOFT" IONIZATITON) NAGYOBB M/Z ARÁNYOKAT EREDMÉNYEZ, AMI A BIOANALIZISBEN IS HASZNÁLHATÓ

16 IONIZÁLÁSI MÓDSZEREK III. MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION (MALDI) –POLÁRIS, NAGYMOLEKULÁJÚ ANYAGOK VIZSGÁLATÁRA –A LÉZERSUGÁRZÁST ABSZORBEÁLÓ MÁTRIX ALKALMAZÁSÁVAL NAGY MOLEKULATÖMEGÜ VEGYÜLETEK VIZSGÁLATA VÁLT LEHETŐVÉ –NAGYON KICSI MENNYISÉGÜ MINTÁT IGÉNYEL –AZ IONOK ASSZOCIÁCIÓJA EZÉRT CSEKÉLYEBB MÉRTÉKÜ –A MINTA MOLEKULÁI EGYENLETESEN DISZPERGÁLVA VANNAK A MÁTRIXBAN (SZILÁRD OLDAT) –A LÉZERREL GERJESZTETT MÁTRIXBÓL MINTA RÉSZECSKÉK LÉPNEK KI, MELYEKET SEMLEGES ÉS GERJESZTETT MÁTRIXMOLEKULÁK VESZNEK KÖRÜL –A MÁTRIXMOLEKULÁK ELPÁROLOGVA GERJESZTETT MINTA MOLEKULÁT HAGYNAK VISSZA –TIPIKUSAN (M+X)+ IONOK KELETKEZNEK, AHOL X= H, Li, Na, K STB.) ILL. KISEBB MENNYISÉGBEN TÖBBSZÖRÖS TÖLTÉSÜ RÉSZECSKÉK –NEGATIV IONOK IS KELETKEZNEK DEPROTONÁLÓDÁSSAL (M)-

17 ANALIZÁTOROK I. TIME-OF-FLIGHT (TOF) –A LEGEGYSZERÜBB ANALIZÁTOR –NAGYON ÉRZÉKENY –GYAKORLATILAG NINCS TÖMEGHATÁR –AZ ALKALMAZOTT POTENCIÁLKÜLÖNBSÉG A FORRÁS ÉS A DETEKTOR KÖZÖTT FELGYORSITJA AZ IONOKAT –IDEÁLIS ESETBEN MINDEN ION EGYSZERRE HAGYJA EL A FORRÁST, UGYANAKKORA ENERGIÁVAL. IGY A REPÜLÉSI IDŐ CSAK A TÖMEGTŐL ÉS A TÖLTÉSTŐL FÜGG. –NAGY FELBONTÁSÚ MÉRÉSHEZ VISZONYLAG HOSSZÚ CSŐBEN KEL MÉRNI

18 A TOF tömegspektrometriás mérések sémája és alapegyenlete mi = mass of analyte ion zi = charge on analyte ion E = extraction field ti = time-of-flight of ion ls = length of the source ld = length of the field-free drift region e = electronic charge (1.6022x10-19 C) TOF

19 ANALIZÁTOROK II. QUADRUPOLE ANALIZÁTOROK –KETTŐ-KETTŐ ELLENTÉTES TÖLTÉSÜ RÚDON EGY SZINUSZOSAN VÁLTAKOZÓ RF TERET ALAKITANAK KI. AZ IONOK A RUDAK KÖZÖTT OSZCILLÁLNAK. MEGFELELŐ FESZÜLTSÉG-KÜLÖNBSÉG ÉS FREKVENCIA ESETÉN CSAK EGYETLEN M/Z JUT EL A DETEKTORBA, A TÖBBI NAGYOBB AMPLITUDÓVAL OSZCILLÁLVA BELEÜTKÖZIK VALAMELYIK RÚDBA. –AZ OSZCILÁCIÓS FREKVENCIA PRAKTIKUS OKOKBÓL 1-2 MHZ –A RUDAK MÉRETE SZABJA MEG A TÖMEGINTERVALLUMOT ÉS A FELBONTÁST, AMI ÁLTALÁBAN 4000 DA (A FELBONTÁS 2000)

20 Kettő szemben levő rúd +(U+Vcos(  t)) potenciállal rendelkezik mig a másik kettő -(U+Vcos(  t))-vel ahol U egy adott optimális, stabil potenciál és Vcos(  t) a rádiófrekvenciás tér (RF), melynek amplitúdója V és frekvenciája . Amikor cos(  t) időben periodikusan változik,, az alkalmazott feszültség az ellentétes rúdpárok között szinuszosan vált6zik, de ellentétes polaritással. A kvadrupól elrendezés központi tengelye mentén és az egymás melletti rudak között is az eredő elektromos tér zérus. A transzverzális irányban egy ion bonyolult módon oszcillálni fog a rudak között, m/z értékétől, a feszültségtől, V-től és a frekvenciától függően. U, V és  alkalmas megválasztásával csak egy adott m/z értékkel rendelkező ionok fognak stabilan keresztül oszcillálni a rudak között, és eljutni a detektorig. Az összes többi ion nagyobb amplitudóval fog rendelkezni, és a rudak egyikébe ütközik. A gyakorlatban ez a frekvencia, , általában 1-2 MHz. A rudak hossza és átmérője megszabja a tömegtartományt és a felbontást. Ezzel az analizátorral vizsgálható tömeg határ 4000Da kb körüli felbontással. KVADRUPÓL

21 ANALIZÁTOROK III. IONCSAPDA ANALIZÁTOR –ÚGY MÜKÖDIK MINT A RÉSZECSKEGYORSITÓK –A BEVEZETETT IONOKAT FÓKUSZÁLJÁK, KÜLÖNBÖZŐ FESZÜLTSÉGEKET ALKALMAZVA "CSAPDÁZZÁK" ILL. ELENGEDIK A KÜLÖNBÖZŐ TÖLTÉSÜ ÉS TÖMEGÜ IONOKAT. –MEGFELELŐEN KIALAKITOTT 3D POTENCIÁL TÉR AZ IONOKAT STABIL PÁLYÁKRA KÉNYSZERITI (FOGLYUL EJTI). –A DETEKTÁLÁS SORÁN VÁLTOZTATJÁK AZ ELEKTRÓDRENDSZER POTENCIÁLJÁT, ÉS IGY INSTABILLÁ VÁLNAK AZ IONPÁLYÁK, MELYNEK KÖVETKEZTÉBEN A CSAPDA ELERESZTI AZ IONOKAT A TENGELY IRÁNYÁBA. –AZ ELERESZTETT IONOK A TÖMEG/TÖLTÉS NÖVEKVŐ ARÁNYA SZERINTI SORRENDBEN REFÓKUSZÁLHATÓAK ÉS DETEKTÁLHATÓAK.

22 FOURIER TRANSFORMÁCIÓS ION-CYCLOTRON REZONANCIA (FT-ICR) F = Lorentz force (observed by the incident ion) B 0 = ICR magnetic field m i = mass of the ion z i = charge on the ion v = incident velocity of the ion  c = induced rotational (cyclotron) frequency

23 KVADRUPÓL IONCSAPDA ANALIZÁTOR

24 Vannak még lehetőségek....


Letölteni ppt "NAGY ÁTBOCSÁTÓ KÉPESSÉGŰ ANALITIKAI MÓDSZEREK (High Throughput Analytical Methods)"

Hasonló előadás


Google Hirdetések