Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013). SEJTTENYÉSZTÉS A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása ELŐNYEI: Jól definiált és módosítható.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013). SEJTTENYÉSZTÉS A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása ELŐNYEI: Jól definiált és módosítható."— Előadás másolata:

1 SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013)

2 SEJTTENYÉSZTÉS A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása ELŐNYEI: Jól definiált és módosítható környezet Meghatározott sejttípusok Nagy mennyiségű sejt nyerhető Sok sejtfunkció vizsgálható Állatkísérletek részbeni kiváltása Vizsgálhatók emberi sejtek 2 2 KORLÁTAI: Nem modellezi a szervezet komplexitását Spontán in vitro evolúció

3 SEJTTENYÉSZET Növekedési mód: Monolayer Szuszpenzió Típus: Primer tenyészet Sejttörzs Sejtvonal

4 Petricsésze sejtkolóniákkal 100 mm Egyetlen sejt - SEM 0.01 mm Sejtkolónia 1 mm 3

5 PRIMER TENYÉSZET A sejtek közvetlenül egy szövetdarabból származnak Először 1907-ben alkalmazták: Gerincvelő explantátum + nyirok 1 nap A tenyészetben axonok jelennek meg! 4

6 Tenyésztett neuron fejlődő nyúlványokkal 5

7 SEJTTÖRZS Primer tenyészetből ered Szövetdarab =explantátum Sejtek izolálása sejtek Sejtek kiültetése tápfolyadék tenyésztőedény A letapadt sejtek osztódnak,növekednek és monolayert képeznek Tápfolyadék szükséges a növekedéshez osztódás után a sejtek meghalnak (Hayflick szabály) 6

8 SEJTVONAL Halhatatlan, immortalizált Genetikai hibák (aneuploidia) Kontaktgátlás elvesztése Korlátlan növekedés Csökkent adhéziójú, esetleg szuszpenziós tenyészet Egérben tumort képezhet Vagy transzformálódott sejtekből ered (spontán vagy karcinogének, vírusok, besugárzás révén) pl. 3T3 21F vonal, CHO Vagy tumorból származik pl. HeLA vonal - méhnyakrákból származó (Henrietta Lacks, 1951) 7

9 Normális Vírus transzformált Kontaktgátlás vanEgymásra növő,felgömbölyödő sejtek 8

10 normális sejtek transzformált sejtek SEM 9

11 10

12 A sejtmorfológia változik a denzitással!! HeLa monolayer sejttenyészet Egymásra nőtt sejtek 11

13 OLDOTT ANYAGOK Tápfolyadék Szérum Hormonok Növekedési faktorok Letapadási faktorok MÁTRIX KÖLCSÖNHATÁSOK Tenyésztő felület pl. műanyag, üveg, membránok, mikrogyöngyök Bevonat (coat) pl. kollagén, zselatin, feeder layer (tápláló sejtréteg) Matrigel, Biomatrix FIZIKAI PARAMÉTEREK Hőmérséklet pH (indikátor+puffer) Oxigén/Széndioxid konc. Páratartalom Ozmolaritás Statikus vagy dinamikus tenyészet SEJTEK ÉS SEJTKÖL- CSÖNHATÁSOK Sejtkölcsönhatás: homológ = sejt denzitás heterológ = együtt- tenyésztés (co-culture) Metabolitok és termékek autokrin és parakrin hatás Anyagcsere ráta STERILITÁS + OPTIMÁLIS KÖRNYEZETI FELTÉTELEK, 12

14 SEJTSZÁMOLÁS Mit?  Összsejtszámot  Csak az élő sejteket – pl. tripánkék exklúzió után Mivel?  Hemocitométerrel (Általában Bürker-kamrával)  Automatizált sejtszámlálóval (pl. hematológiai citométer vagy FACS stb.) 14

15 Automatizált sejtszámlálás A mérés alapja: vagy impedancia meghatározás vagy fényszóródáson alapuló meghatározás

16 Neubauer Thoma Burker Módosított Fuchs-Rosenthal Tökéletesített Neubauer Különböző típusú hemocitométerek 16

17 H H Élő sejt Halott sejtek TRIPÁNKÉK EXKLUZIÓ (KIZÁRÁS) = CSAK A HALOTT SEJTEK FESTŐDNEK 17

18 1 mm Az 1 mm 2 -en számolandó sejtek 18

19 A 3 vonallal határolt négyzet össztérfogata = 1 mm 2 x 0,1 mm = 0,1 mm 3 = ml (= 0,1 cm x 0,1 cm x 0,01 cm =10 -4 cm 3 = ml) 19

20 A SEJTSZÁM VÁLTOZÁSA AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN Konfluens tenyészet 20

21 SEJTSZÁM VÁLTOZÁS AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN 1. lag fázis 2. log fázis 3. plató fázis tápcsere nélkül sejtpusztulás 21

22 96 lyukú plate myeloma sejtek IgM termelő 4G12 hybridoma sejtek SZUSZPENZIÓS TENYÉSZET: nem letapadó, úszó, általában hemopoetikus vagy erősen transz- formált daganatos sejtek, nem igényelnek speciális felületet. 22

23 23

24 1) Immunizálás 2) B sejt izolálás lépből (3) Myeloma sejtek tenyésztése (4) Myeloma sejtek és B sejtek fúziója (5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA I. 24

25 HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA II. (5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) (6) A megfelelő vonalak kiválasztása (7) in vitro (a) vagy in vivo (b) sokszorozás (8) Kinyerés 25

26 Antigén Lépsejtek Ellenanyag Myeloma sejtek Myeloma sejtvonal tenyészete Hibrid sejtek szelekciója és felszaporítása Sejtfúzió polietilén glikolban A kívánt klónok felszaporítása Tumor- indukció Fagyasztás Visszavétel fagyasztásból A kívánt specifitású ellenanyagot termelő sejtek kiválasztása Tenyésztés in vitro 26

27 HIBRID SEJTEK SZELEKCIÓJA HAT szelekció = hipoxantin-aminopterin-timidin médium általi szelekció Genotípus * TK- TK-/TK+ TK+ Halhatatlan HAT-érzékeny myeloma sejtvonal Fuzionált hibrid sejtek Lépből izolált rövidéletű B sejtek Sejttípus HAT szelekció következménye Meghal Túlél Meghal Magyarázat Nem tud DNS-t szintetizálni: 1/ a funkcióvesztéses TK mutáció miatt nem képes az alternatív DNS szintézisre 2/ az aminopterin gátolja a de novo DNS szintézist Halhatatlan és a DNS szintézis helyreállított: 1/ a halhatatlanságot a myeloma sejtvonal- tól kapja 2/ az alternatív DNS szintézis képessége a B sejtektől származik Korlátozott élettartam: 1/ DNS szintézisre képes, de fokozatosan kihal, mert kevésbé képesek osztódni TK: timidin kináz Aminopterin = a de novo DNS szintézis inhibitora Hipoxantin = purin származék Timidin = dezoxinukleozid * = HGPRT (hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz) mutánsok is használhatók a TK mutánsok helyett DNS szintézis intermedierek

28 SPECIÁLIS TENYÉSZTÉSI TÍPUSOK Feeder layer = Tápláló sejtréteg = sejtosztódásában gátolt, de még élő sejtek használata ES sejtekhez Tömegtenyészet (spinner flaskák, sejtgyárak, bioreaktorok stb.) Mikrogyöngyön való tenyésztés Szemi-szolid médiumban (elsősorban metilcellulóz tartalmú tápban) való tenyésztés hemopoetikus sejtekhez 28

29 D3 ES (embrionális ős)sejtek fibroblaszt feeder layeren R1 ES sejtek fibroblaszt feeder layeren 29

30 MIKROGYÖNGYÖN TENYÉSZŐ SEJTEK Sytox orange magfestés 30

31 BIOREAKTOR ml-ben 3 x 10 8 sejt tenyészthető!!

32 Sejtgyár = cell factory tenyésztőtálca, 6320 cm 2 felület, 2000 ml tápfolyadék

33 SZUSZPENZIÓS TENYÉSZETEK SEJTJEINEK VIZSGÁLATA Kenet Vastagcsepp Cytocentrifuga 37

34 Kenetkészítés VÉRKENET KÉSZÍTÉS 38

35 CITOCENTRIFUGÁLÁS 39

36 FACS hisztogramok Giemsa festett citocentrifugált sejtek Nyilak = dentritikus sejtek; nyílhegyek = monocita-szerű sejtek; inzertek = makrofágok (e), monocita-szerű sejtek (f), CD11b - CD4 - sejtek (g), plasmacytoid dentritikus sejtek (h) 40

37 Dil-LDL felvétel MakrofágEndothel sejt DiI-LDL = fluorokrómmal jelölt LDL (low density lipoprotein). Felvételére csak a makrofágok és az endothel sejtek képesek. 41

38 Antigének T sejt proliferációt fokozó hatásának kimutatása Specifikus hatás 42

39 MITOGÉNCÉLSEJT Concanavalin A (ConA) T sejtek Phytohem- agglutinin (PHA) T sejtek Pokeweed mitogén (PWM) T és B sejtek Lipopoliszacharid (LPS) B sejtek Növényi eredetűek Bakteriális eredetű Limfociták „blasztosítására” használt anyagok Sejtproliferációt indukáló hatásuk hasonló az antigének által kiváltotthoz, de aspecifikus 43

40 Sejtszeparálás Sűrűségradiensen Mágneses mikrogyöngyök segítségével Rozettaképzéssel FACS -szal 44

41 Sűrűséggradiens révén történő fehérvérsejt (limfocita, monocita) szeparálás 45

42 A MACS ® mikrogyöngyök olyan ellenanyaggal jelölt mágneses részecskék, amelyek a sejt felszínén lévő markerekhez kötődve azokat mágnesesen jelölik. A cél az, hogy a jelölt sejt szerkezete, funkciója, aktivitása nem változzon. A MACS® mikrogyöngyök nanopartikulumok. A képen egyCD8 mikro- gyönggyel izolált CD8 + T sejt látható. (A mikrogyönygyök nem láthatóak.) Egy CD8 + T sejt TEM-es felvétele. A nyílhegy a CD8 mikrogyöngyöt mutatja a sejt felszínén. SEM = scanning (pásztázó) elektronmikroszkóp TEM = transzmissziós elektronmikroszkóp 46 Mágneses sejt szeparálás

43 Mágneses jelölés Egy rövid inkubációs lépésben mikrogyön- gyökkel mágnesesen jelöljük a sejteket. Mágneses szeparálás A sejteket MACS mágne- ses szeparátorba helye- zett oszlopon különítjük el. Az átfolyó frakció már nem tartalmazza a jelölt sejteket. A jelölt sejtek kinyerése Ha az oszlopot kivesszük a mágneses szeparátorból, a Visszatartott mágnesesen jelölt sejtek egyszerűen ki- folynak. Negatív szelekció Pozitív szelekció 47 ellenanyag mágneses mikrogyöngy sejt mágnes

44 MACS ® szeparátor és oszlop mágnes oszlop 48

45 49 Csak negatív B-sejt negatív szelekcióra alkalmas, mert az anti-CD3-mal szelektált T sejtek aktiválódnak.

46 Rozettaképzés

47 51

48 20 perc inkubálás szobahőmérsékleten Jelölés Centrifugálás A tetramer ellenanyag komplex keresztkötést hoz létre a nem- kívánt sejtek és a vörösvértestek között Feldúsult (rozettát nem képező) sejtek RosetteSep® ellenanyag koktél hozzáadása Ficoll®-ra rétegzés Ficoll ® Plazma Feldúsult sejtek Ficoll Vvt-k és nem kívánt sejtek (rozettaképzés) Kinyerés 52

49 RosetteSep ® -pel történt NK sejt dúsítás FACS hisztogramja 53

50 GENETIKA Transzformáció Sejtfúzió Sejtciklus SEJTBIOLÓGIA Sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatások Génexpresszió Sejtproliferáció Differenciáció Sejt-migráció, -invázió INTRACELLULÁRIS AKTIVITÁS DNS transzkripció RNS metabolizmus Fehérjeszintézis Intermedier anyagcsere BIOTECHNOLÓGIA/ TISSUE ENGINEERING Citokinek/növekedési faktorok, hormonok, ellenanyagok termeltetése Mesterséges szövetek KÖRNYEZETI KÖLCSÖNHATÁSOK Fertőzések (vírus, baktérium, parazita) Toxikológia Immunológia Karcinogenezis Xenobiotikumok biotranszformációja 54 SEJTTENYÉSZTÉS ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI

51 Irodalom Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 8. fejezet. Következő hét: Komplement; Immunsejtek migrációja Fülöp A. K (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 4 és 9. fejezet. Falus A, Buzás E., Rajnavölgyi É. (Szerk.): Az immunológia alapjai, 3.5. fejezet

52 FAKULTATÍV Példák a sejttenyésztés alkalmazási lehetőségeire 55

53 Differenciálódási vizsgálatok 57

54 iPS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek 58

55 iPS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek Jövőbeli felhasználás? 59

56 EX-VIVO TERÁPIA 60

57 Hemopoietikus őssejtek (HSC-k) módosítása 61

58 Az immunterápia általános stratégiája

59

60 Mesterséges szövetek Erek – aorta Máj Csont Porc Bőr Retina 64

61 Különböző korú és denzitású emberi bőrhámsejt tenyészetek 65

62 Emberi bőrhámsejt tenyészet felhasználásával helyreállított égési sérülés 5 évvel a pótlás után 66

63 TISSUE ENGINEERING Mesterséges szövetek konstruálása Implantáció Fehérje szekréció Gén bejuttatás Oszteogenetikus faktor Biopszia Sejtek hozzáadása Váz= scaffold 67

64 Szövetbarát scaffold, saját sejtekkel benövesztve nem immunogén 68

65 Bioreaktor pl. ellenanyag termelésre 69

66 PULZÁLÓ CARDIOMYOCYTA: BIOPACEMAKER? 70

67 Inzulin termeltetés differenciáltatott ES sejtekkel 71

68 Vírus neutralizációs teszt A HeLa sejteket megöli a poliovírus (cytopathic effect) A sejteket 96 lyukú lemezen szélesztették. Az egyikben fertőzöttek voltak a sejtekben, a másikban nem. Egy idő után a sejteket kristályibolyával festették, mely csak az elő sejteket festi. Melyik lyuk tartalmazta a fertőzött sejteket? Az alsó ábrán a fertőzés előtt szérummal inkubálták a vírusokat. Ha specifikus antivirális antitets volt jelen, az gátolta a fertőzést. Neutralizációs titernek nevezik annak a legnagyobb hígításnak a reciprokát, amely még gátolja a fertőzést. Mennyi a neutralizációs titer? (egy mintát vizsgáltak 3 párhuzamos mérésben)

69 MDCK (Madine Darby canine kidney) tenyészet mikrogyöngyökön influenza fertőzés előrehaladtának kimutatása immuncitokémiával 1 óra5 óra 22 óra 72

70 Centrifugálás Magzatvíz Amnionüreg Méhfal Sejttenyésztés Biokémiai vizsgálatok, kromoszóma analízis, DNS vizsgálatok Folyadék - Összetétel elemzés Sejtek - Nem meghatározás, biokémiai és enzim vizsgálatok Placenta Amniocentézis 73

71 Minden 6 sejttenyészetből 1 Mycoplasma fertőzött Szérum Személy- zet Tripszin Kereszt- fertőzés Ellen- őrzött forrásból Kimutatás Kiirtás Megelőzés Ellen- őrzött forrásból DiagnózisKezelés 74

72 Mycoplasma fertőzött tenyészet sejtjei (Hoechst festés) Nem fertőzött tenyészet sejtjei (Hoeschst festés) 75

73 Mycoplasma fertőzött HeLa tenyészet sejtjei (DAPI festés) HeLa tenyészet sejtjei Mycoplasma irtás után (DAPI festés) 76


Letölteni ppt "SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013). SEJTTENYÉSZTÉS A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása ELŐNYEI: Jól definiált és módosítható."

Hasonló előadás


Google Hirdetések