Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013)

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013)"— Előadás másolata:

1 SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013)

2 A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása
SEJTTENYÉSZTÉS 2 A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása ELŐNYEI: Jól definiált és módosítható környezet Meghatározott sejttípusok Nagy mennyiségű sejt nyerhető Sok sejtfunkció vizsgálható Állatkísérletek részbeni kiváltása Vizsgálhatók emberi sejtek KORLÁTAI: Nem modellezi a szervezet komplexitását Spontán in vitro evolúció 2

3 SEJTTENYÉSZET Növekedési mód: Típus: Monolayer Szuszpenzió
Primer tenyészet Sejttörzs Sejtvonal

4 Egyetlen sejt - SEM Sejtkolónia Petricsésze sejtkolóniákkal 0.01 mm
3

5 Gerincvelő explantátum
PRIMER TENYÉSZET A sejtek közvetlenül egy szövetdarabból származnak Először 1907-ben alkalmazták: Gerincvelő explantátum + nyirok 1 nap A tenyészetben axonok jelennek meg! 4

6 Tenyésztett neuron fejlődő nyúlványokkal
5

7 SEJTTÖRZS Primer tenyészetből ered tápfolyadék kiültetése Sejtek
Szövetdarab =explantátum Sejtek izolálása sejtek kiültetése tápfolyadék tenyésztőedény A letapadt sejtek osztódnak,növekednek és monolayert képeznek Tápfolyadék szükséges a növekedéshez osztódás után a sejtek meghalnak (Hayflick szabály) 6

8 SEJTVONAL Halhatatlan, immortalizált Genetikai hibák (aneuploidia)
Kontaktgátlás elvesztése Korlátlan növekedés Csökkent adhéziójú, esetleg szuszpenziós tenyészet Egérben tumort képezhet Vagy transzformálódott sejtekből ered (spontán vagy karcinogének, vírusok, besugárzás révén) pl. 3T3 21F vonal, CHO Vagy tumorból származik pl. HeLA vonal - méhnyakrákból származó (Henrietta Lacks, 1951) 7 Sejttenyésztés videó:

9 Normális Vírus transzformált Kontaktgátlás van
Egymásra növő,felgömbölyödő sejtek 8

10 normális sejtek transzformált sejtek SEM 9

11 10

12 HeLa monolayer sejttenyészet
A sejtmorfológia változik a denzitással!! HeLa monolayer sejttenyészet Egymásra nőtt sejtek 11

13 STERILITÁS + OPTIMÁLIS KÖRNYEZETI FELTÉTELEK,
OLDOTT ANYAGOK Tápfolyadék Szérum Hormonok Növekedési faktorok Letapadási faktorok MÁTRIX KÖLCSÖNHATÁSOK Tenyésztő felület pl. műanyag, üveg, membránok, mikrogyöngyök Bevonat (coat) pl. kollagén, zselatin, feeder layer (tápláló sejtréteg) Matrigel, Biomatrix FIZIKAI PARAMÉTEREK Hőmérséklet pH (indikátor+puffer) Oxigén/Széndioxid konc. Páratartalom Ozmolaritás Statikus vagy dinamikus tenyészet SEJTEK ÉS SEJTKÖL- CSÖNHATÁSOK Sejtkölcsönhatás: homológ = sejt denzitás heterológ = együtt- tenyésztés (co-culture) Metabolitok és termékek autokrin és parakrin hatás Anyagcsere ráta STERILITÁS + OPTIMÁLIS KÖRNYEZETI FELTÉTELEK, 12

14 SEJTSZÁMOLÁS Mit? Mivel? Összsejtszámot
Csak az élő sejteket – pl. tripánkék exklúzió után Mivel? Hemocitométerrel (Általában Bürker-kamrával) Automatizált sejtszámlálóval (pl. hematológiai citométer vagy FACS stb.) 14

15 Automatizált sejtszámlálás
A mérés alapja: vagy impedancia meghatározás vagy fényszóródáson alapuló meghatározás

16 Különböző típusú hemocitométerek
Neubauer Thoma Burker Módosított Fuchs-Rosenthal Tökéletesített Neubauer Különböző típusú hemocitométerek 16

17 TRIPÁNKÉK EXKLUZIÓ (KIZÁRÁS) = CSAK A HALOTT SEJTEK FESTŐDNEK
Élő sejt Halott sejtek TRIPÁNKÉK EXKLUZIÓ (KIZÁRÁS) = CSAK A HALOTT SEJTEK FESTŐDNEK 17

18 Az 1 mm2-en számolandó sejtek
18

19 A 3 vonallal határolt négyzet össztérfogata =
1 mm2 x 0,1 mm = 0,1 mm3 = 10-4 ml (= 0,1 cm x 0,1 cm x 0,01 cm =10-4 cm3 = 10-4 ml) 19

20 A SEJTSZÁM VÁLTOZÁSA AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN
Konfluens tenyészet 20 Mozog! sejtmorfológia változása a sejtdenzitás függvényében

21 SEJTSZÁM VÁLTOZÁS AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN
1. lag fázis 2. log fázis 3. plató fázis tápcsere nélkül sejtpusztulás 21

22 SZUSZPENZIÓS TENYÉSZET: nem letapadó, úszó, általában
96 lyukú plate myeloma sejtek IgM termelő 4G12 hybridoma sejtek SZUSZPENZIÓS TENYÉSZET: nem letapadó, úszó, általában hemopoetikus vagy erősen transz- formált daganatos sejtek, nem igényelnek speciális felületet. 22

23 23

24 HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA I.
1) Immunizálás 2) B sejt izolálás lépből (3) Myeloma sejtek tenyésztése (4) Myeloma sejtek és B sejtek fúziója (5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA I. 24

25 HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA II.
(5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) (6) A megfelelő vonalak kiválasztása (7) in vitro (a) vagy in vivo (b) sokszorozás (8) Kinyerés 25 HAT = hipoxantin-aminopterin-timidin

26 26 Antigén Lépsejtek Ellenanyag Myeloma sejtek Myeloma sejtvonal
tenyészete Hibrid sejtek szelekciója és felszaporítása Sejtfúzió polietilén glikolban A kívánt klónok felszaporítása Tumor- indukció Fagyasztás Visszavétel fagyasztásból A kívánt specifitású ellenanyagot termelő sejtek kiválasztása Tenyésztés in vitro 26

27 HIBRID SEJTEK SZELEKCIÓJA
HAT szelekció = hipoxantin-aminopterin-timidin médium általi szelekció Genotípus* TK TK-/TK TK+ Halhatatlan HAT-érzékeny myeloma sejtvonal Fuzionált hibrid sejtek Lépből izolált rövidéletű B sejtek Sejttípus HAT szelekció következménye Meghal Túlél Meghal Magyarázat Nem tud DNS-t szintetizálni: 1/ a funkcióvesztéses TK mutáció miatt nem képes az alternatív DNS szintézisre 2/ az aminopterin gátolja a de novo DNS szintézist Halhatatlan és a DNS szintézis helyreállított: 1/ a halhatatlanságot a myeloma sejtvonal- tól kapja 2/ az alternatív DNS szintézis képessége a B sejtektől származik Korlátozott élettartam: 1/ DNS szintézisre képes, de fokozatosan kihal, mert kevésbé képesek osztódni TK: timidin kináz Aminopterin = a de novo DNS szintézis inhibitora Hipoxantin = purin származék Timidin = dezoxinukleozid * = HGPRT (hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz) mutánsok is használhatók a TK mutánsok helyett DNS szintézis intermedierek

28 SPECIÁLIS TENYÉSZTÉSI TÍPUSOK
Feeder layer = Tápláló sejtréteg = sejtosztódásában gátolt, de még élő sejtek használata ES sejtekhez Tömegtenyészet (spinner flaskák, sejtgyárak, bioreaktorok stb.) Mikrogyöngyön való tenyésztés Szemi-szolid médiumban (elsősorban metilcellulóz tartalmú tápban) való tenyésztés hemopoetikus sejtekhez 28

29 D3 ES (embrionális ős)sejtek fibroblaszt feeder layeren
R1 ES sejtek fibroblaszt feeder layeren 29

30 MIKROGYÖNGYÖN TENYÉSZŐ SEJTEK
Sytox orange magfestés 30

31 BIOREAKTOR 32 15 ml-ben 3 x 108 sejt tenyészthető!!

32 Sejtgyár = cell factory
33 10 tenyésztőtálca, 6320 cm2 felület, 2000 ml tápfolyadék

33 SZUSZPENZIÓS TENYÉSZETEK SEJTJEINEK
VIZSGÁLATA Kenet Vastagcsepp Cytocentrifuga 37

34 Kenetkészítés VÉRKENET KÉSZÍTÉS 38

35 CITOCENTRIFUGÁLÁS 39

36 Giemsa festett citocentrifugált sejtek
FACS hisztogramok Giemsa festett citocentrifugált sejtek Nyilak = dentritikus sejtek; nyílhegyek = monocita-szerű sejtek; inzertek = makrofágok (e), monocita-szerű sejtek (f), CD11b-CD4- sejtek (g), plasmacytoid dentritikus sejtek (h) Four-color flow cytometry and cytospin preparations of sorted subsets from synovium-rich tissue 14 days after adoptive transfer. The MHC IIhi cells (a) were analysed for expression of CD4 and/or CD11b (b). The fourth fluorochrome was used to detect expression of either CD11c (c) or CD163 (d) by the CD11b+ subsets. (e) Giemsa-stained cytospin preparations of the sorted CD11b+CD4+ subpopulation consisted mainly of cells with dendritic cell (DC) (arrows) or monocyte-like (arrowhead) morphology with a few cells of typical macrophage morphology (inset). (f) Giemsa-stained cytospin preparations of the sorted CD11b+CD4- subpopulation consisted mainly of cells with DC (arrows) or monocyte-like (arrowhead and inset) morphology. The sorted CD11b-CD4+ (g) and CD11b-CD4- (h) cells had morphology consistent with that described for plasmacytoid DCs. Objective, × 60. MHC, major histocompatibility complex. 40

37 Dil-LDL felvétel Makrofág Endothel sejt
DiI-LDL = fluorokrómmal jelölt LDL (low density lipoprotein). Felvételére csak a makrofágok és az endothel sejtek képesek. 41

38 Antigének T sejt proliferációt fokozó
hatásának kimutatása Specifikus hatás 42 Citokintermelést is lehet mérni. Lásd ELISPOT (TBC,INF-g) 2. prezentációban.

39 Phytohem-agglutinin (PHA) Pokeweed mitogén (PWM) T és B sejtek
Limfociták „blasztosítására” használt anyagok MITOGÉN CÉLSEJT Concanavalin A (ConA) T sejtek Phytohem-agglutinin (PHA) Pokeweed mitogén (PWM) T és B sejtek Lipopoliszacharid (LPS) B sejtek Növényi eredetűek A Pokeweed mitogén az álkörmös = Phytolacca americanaból; a ConcanavalinA a kardbab = Concanavalia ensiformisból; a phytohemagglutinin a bab= Phaseolus vulgarisból származó lektin Bakteriális eredetű Sejtproliferációt indukáló hatásuk hasonló az antigének által kiváltotthoz, de aspecifikus 43

40 Sejtszeparálás Sűrűségradiensen Mágneses mikrogyöngyök segítségével
Rozettaképzéssel FACS -szal 44

41 Sűrűséggradiens révén történő
fehérvérsejt (limfocita, monocita) szeparálás A FICOLL = nagy molekulatömegű, elágazó, neutrális, vízoldékony poliszacharidokból áll. 45

42 Mágneses sejt szeparálás
A MACS® mikrogyöngyök olyan ellenanyaggal jelölt mágneses részecskék, amelyek a sejt felszínén lévő markerekhez kötődve azokat mágnesesen jelölik. A cél az, hogy a jelölt sejt szerkezete, funkciója, aktivitása nem változzon. nanopartikulumok. A képen egyCD8 mikro- gyönggyel izolált CD8+ T sejt látható. (A mikrogyönygyök nem láthatóak.) Egy CD8+ T sejt TEM-es felvétele. A nyílhegy a CD8 mikrogyöngyöt mutatja a sejt felszínén. SEM = scanning (pásztázó) elektronmikroszkóp TEM = transzmissziós elektronmikroszkóp 46

43 Negatív szelekció Pozitív szelekció Mágneses jelölés
Egy rövid inkubációs lépésben mikrogyön- gyökkel mágnesesen jelöljük a sejteket. Mágneses szeparálás A sejteket MACS mágne- ses szeparátorba helye- zett oszlopon különítjük el. Az átfolyó frakció már nem tartalmazza a jelölt sejteket. A jelölt sejtek kinyerése Ha az oszlopot kivesszük a mágneses szeparátorból, a Visszatartott mágnesesen jelölt sejtek egyszerűen ki- folynak. Negatív szelekció Pozitív szelekció 47 ellenanyag mágneses mikrogyöngy sejt mágnes

44 MACS® szeparátor és oszlop
mágnes oszlop 48

45 Csak negatív B-sejt negatív szelekcióra alkalmas,
mert az anti-CD3-mal szelektált T sejtek aktiválódnak. 49

46 Rozettaképzés

47 Rozettaképzés 51

48 Jelölés Centrifugálás Kinyerés 52 RosetteSep® ellenanyag koktél
20 perc inkubálás szobahőmérsékleten Jelölés Centrifugálás A tetramer ellenanyag komplex keresztkötést hoz létre a nem- kívánt sejtek és a vörösvértestek között Feldúsult (rozettát nem képező) sejtek RosetteSep® ellenanyag koktél hozzáadása Ficoll®-ra rétegzés Ficoll ® Plazma Feldúsult sejtek Ficoll Vvt-k és nem kívánt sejtek (rozettaképzés) Kinyerés 52

49 RosetteSep®-pel történt NK sejt dúsítás FACS hisztogramja
53

50 SEJTTENYÉSZTÉS ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI
GENETIKA Transzformáció Sejtfúzió Sejtciklus SEJTBIOLÓGIA Sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatások Génexpresszió Sejtproliferáció Differenciáció Sejt-migráció, -invázió INTRACELLULÁRIS AKTIVITÁS DNS transzkripció RNS metabolizmus Fehérjeszintézis Intermedier anyagcsere BIOTECHNOLÓGIA/ TISSUE ENGINEERING Citokinek/növekedési faktorok, hormonok, ellenanyagok termeltetése Mesterséges szövetek KÖRNYEZETI KÖLCSÖNHATÁSOK Fertőzések (vírus, baktérium, parazita) Toxikológia Immunológia Karcinogenezis Xenobiotikumok biotranszformációja 54 SEJTTENYÉSZTÉS ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI

51 Következő hét: Komplement; Immunsejtek migrációja
Irodalom Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 8. fejezet. Következő hét: Komplement; Immunsejtek migrációja Fülöp A. K (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 4 és 9. fejezet. Falus A, Buzás E., Rajnavölgyi É. (Szerk.): Az immunológia alapjai, 3.5. fejezet

52 FAKULTATÍV Példák a sejttenyésztés alkalmazási lehetőségeire
55

53 Differenciálódási vizsgálatok
57

54 iPS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek
58

55 Jövőbeli felhasználás?
iPS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek Jövőbeli felhasználás? Yamanaka-koktél = Oct-3/4, SOX2, c-Myc és Klf4 géneket tartalmazó vektorok keveréke. Az ezzel történt transzfekció nyomán alakultak vissza a felnőtt, differenciálódott sejtek pluripotens őssejtekké. (Dr. Shinya Yamanaka dolgozta ki a módszert.) 59

56 EX-VIVO TERÁPIA 60

57 Hemopoietikus őssejtek (HSC-k) módosítása
61

58 Az immunterápia általános stratégiája

59 EPCs = endothelial progenitor cells; CEPs = circulating endothelial progenitors

60 Mesterséges szövetek Erek – aorta Máj Csont Porc Bőr Retina 64

61 Különböző korú és denzitású emberi bőrhámsejt tenyészetek
65

62 tenyészet felhasználásával helyreállított égési sérülés
Emberi bőrhámsejt tenyészet felhasználásával helyreállított égési sérülés 5 évvel a pótlás után 66

63 Mesterséges szövetek konstruálása Oszteogenetikus faktor
TISSUE ENGINEERING Mesterséges szövetek konstruálása Implantáció Fehérje szekréció Gén bejuttatás Oszteogenetikus faktor Biopszia Sejtek hozzáadása Váz= scaffold 67

64 saját sejtekkel benövesztve nem immunogén
Szövetbarát scaffold, saját sejtekkel benövesztve nem immunogén 68

65 Bioreaktor pl. ellenanyag
termelésre 69 Májsejt-reaktorok is vannak, szervdonor hiányában pár hétig ezzel túlélhet a beteg.

66 PULZÁLÓ CARDIOMYOCYTA: BIOPACEMAKER?
70

67 differenciáltatott ES sejtekkel
Inzulin termeltetés differenciáltatott ES sejtekkel 71

68 Vírus neutralizációs teszt A HeLa sejteket megöli a poliovírus (cytopathic effect)
A sejteket 96 lyukú lemezen szélesztették. Az egyikben fertőzöttek voltak a sejtekben, a másikban nem. Egy idő után a sejteket kristályibolyával festették, mely csak az elő sejteket festi. Melyik lyuk tartalmazta a fertőzött sejteket? Az alsó ábrán a fertőzés előtt szérummal inkubálták a vírusokat. Ha specifikus antivirális antitets volt jelen, az gátolta a fertőzést. Neutralizációs titernek nevezik annak a legnagyobb hígításnak a reciprokát, amely még gátolja a fertőzést. Mennyi a neutralizációs titer? (egy mintát vizsgáltak 3 párhuzamos mérésben) Neutralizációs titer: 4 Cells have been plated in the small wells of a 96 well plate. One well was infected with virus, the other was not. After a period of incubation, the cells were stained with the dye crystal violet, which stains only living cells. It is obvious which cells were infected with virus and which were not. If the serum contains antibodies that block viral infection, then the cells will survive, as determined by staining with crystal violet. If no antiviral antibodies are present in the serum, the cells will die. The neutralization titer is expressed as the reciprocal of the highest dilution at which virus infection is blocked. In the example shown here, the serum blocks virus infection at the 1:2 and 1:4 dilutions, but less at 1:8 and not at all at 1:16. Each serum dilution was tested in triplicate, which allows for more accuracy. In this sample, the neutralization titer would be 4, the reciprocal of the last dilution at which infection was completely blocked.

69 MDCK (Madine Darby canine kidney) tenyészet mikrogyöngyökön influenza
fertőzés előrehaladtának kimutatása immuncitokémiával 1 óra 5 óra 22 óra 72

70 Amniocentézis Centrifugálás Magzatvíz Amnionüreg Méhfal Sejttenyésztés
Biokémiai vizsgálatok, kromoszóma analízis, DNS vizsgálatok Folyadék - Összetétel elemzés Sejtek - Nem meghatározás, biokémiai és enzim vizsgálatok Placenta Amniocentézis 73

71 Minden 6 sejttenyészetből 1 Mycoplasma fertőzött Személy- zet
Szérum Személy- zet Tripszin Kereszt- fertőzés Ellen- őrzött forrásból Kimutatás Kiirtás Megelőzés Diagnózis Kezelés 74

72 Mycoplasma fertőzött tenyészet sejtjei (Hoechst festés) Nem fertőzött
(Hoeschst festés) 75

73 HeLa tenyészet sejtjei HeLa tenyészet sejtjei
Mycoplasma fertőzött HeLa tenyészet sejtjei (DAPI festés) HeLa tenyészet sejtjei Mycoplasma irtás után (DAPI festés) 76


Letölteni ppt "SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013)"

Hasonló előadás


Google Hirdetések