Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály Budapest,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály Budapest,"— Előadás másolata:

1 KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE,

2 Kompartmentalizáció Prokarióta sejtek Eukarióta sejtek Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma * DNS kettős spirál és a hisztonok alkotják * Hisztonok: bázikus fehérjék (argininben és lizinben gazdag) * 5 osztályuk van: H1H1, H2A, H2B, H3 és H4 nukleoszomális hisztonok Hisztonkorong (oktamer): 8 hisztonmolekulából álló (2*4) 2 csavarulatban 146 bázispárnyi DNS tekeredik rá 2 korong között kb. 60 bp linkerrégió + H1 molekula A DNS kondenzációját a kondenzin foszforilációja indítja el. kohezin ATP-áz

3 Kromoszóma morfológia testvérkromatidák centroméra hosszú kar rövid kar Eukromatikus régió: aktív géneket tartalmaz (génexpresszió, RNS szintézis) Heterokromatikus régió: inaktív DNS szakaszok konstitutív heterokromatin (pl. centromer) fakultatív heteroktromatikus régió

4 Kromoszóma territórium Egy adott kromoszóma a sejtmag egy adott régiójában található. Szigorú sejtmagi rend.

5 Genom: a sejtmagban található összes genetikai információ. Kromoszóma: A genetikai információt tároló strukturális egység. Kromoszóma száma, morfológiája szervezettsége fajra jellemző és állandó. Fajok ecetmuslica rozs galamb egér patkány ember mezei nyúl kutya ponty páfrány Kromoszómaszám Humán kromoszómaGének X1184 (Barr test) Y231 (mikrodeléció meddőség) Nemhez kötött öröklődés G-sávos normál női karyotípus Humán lymphocyta kromoszóma preparátum

6 Telomer: - kromoszóma vége - rövid TTAGGG szakasz több ezerszeres mennyiségben (20-25 ezer bázispár) genetikai óra, telomer rövidülés öregedés 2009 orvosi Nobel Díj - minden osztódáskor 100 bp rövidülés a DNS polimeráz enzim működéséből adódóan - egészséges sejtekben a telomeraz inaktív - Az emberi sejt 50 osztódásra képes osztódás után a sejt apoptózissal meghal. Tumoros sejtekben a telomer szerepe: -a telomeráz enzim aktivitása magasabb -Azt gondolják, hogy a telomeráz enzim retrovírus eredetű. -Ivarsejtekben is! Öregedés, rák, stabil kromoszóma

7 MITOZIS A mitózis gondoskodik a szülői és az utódsejt azonos kromoszómakészletéről. A sejtosztódás S fázisában a kromoszómák anyaga megkettőződik. A mitózis kromoszóma számtartó osztódás. * * *

8 A mitózis és meiózis összehasonlító elemzése

9 X-kromoszóma inaktiváció A nőstény emlősök sejtjeiben Az egyik X-kromoszóma inaktiválódik (random módon), X f X v. Az inaktivált X kondenzálódik - Barr-testecske. Bizonyos sejtek utódai együtt maradnak (sejtklónok). A nőstény emlősök teste mozaikos, vagyis olyan sejtek klónjainak a keveréke, amelyekben hol egyik, hol a másik X aktív. Heterozigótákon detektálhatók lehetnek a foltok. Vörös/fekete tarka macskák esete

10 Hemofilia B IX. faktor A VIII. faktor Nemhez kötött recesszív megbetegedés

11 KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI: Strukturális kromoszóma aberráció: deléció inszerció transzlokáció Numerikus kromoszóma aberráció: poliploidia aneuploidia

12 Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza. A kis deléciók tolerálhatóak. A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.

13 Cri du chat – macskasírás szindróma Az ember esetében a genom kiegyensúlyozatlanság miatt a legkisebb deléciók is komoly abnormalitást okoznak. A macskasírás szindróma estében az 5. kromoszóma rövid (p) karjának vége hiányzik. Mikroencefáliával, holdszerű arccal és szellemi elmaradottsággal jár. 4 év alatti halál. születéskori gyakoriság: 1/50,000

14 Rákos sejtek gyakran mutatnak deléciókat

15 DUPLIKÁCIÓ: Kromoszóma szegmensek megkettőződése. Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

16 Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma különböző

17 A gén duplikáció evolúciós szerepe Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat. De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el. Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek. Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak, a hemoglobin szerkezeti alegységei.

18 A gén duplikáció lehetőséget ad, a mutációs változásoknak, a funkciók divergálásának Az emberi hemoglobin gén duplikációs változások eredménye. Különböző életkorokban különböző alegységek alakítják ki a működő hemoglobin molekulát. 3 hónapos korig az embrionális Hemg. Szülésig a magzati Hemg % Szülés után 2α 2ß.

19 Inverzió: Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának az eredménye. pericentrikus inverzió magába foglalja centromert paracentrikus inverzió a centromert nem érinti, csak a kromoszóma egyik v. másik karját Gén környezet, gén kapcsoltság, génátírás módosul.

20 TRANSZLOKÁCIÓ: intrakromoszómális transzlokáció: Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése ugyanabba a kromoszómába. interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák közötti transzlokáció. Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés. A gének pozíciója azonban megváltozik.

21 14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát.Örökölhető. 21-es kromoszóma triszómia (Osztódási hiba) Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik. Prenatális szűrés. Születéskori gyakorisága nagy: 1/500-1/700 Down szindróma:

22 Myeloid leukémia A 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció eredménye a “Philadelphia kromoszóma” Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

23 Burkitt’s lymphoma Az esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció következménye. Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák keletkezését okozhatják.

24 Alternatív toxikológiai módszerek in vitro vizsgálatok előnyei: 1.in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) 2.rövid idejű 3.olcsóbb 4.reprodukálható 5.nem használ élő állatot Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat egybehangzó eredményére van szükség. Ajánlott teszt rendszerek: 1. Egysejtűeken végzett tesztek 2. Rovartesztek 3. in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek 4. in vivo mutagenitási tesztek 5. long term karcinogenitási állatkísérletek 6. humán epidemiológiai vizsgálatok Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálata

25 Bevezetés A BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE a vegyi anyagok regisztrálásáról,értékeléséről,engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló a 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról. B.rész.:Módszerek a toxicitás és egyéb egészségügyi hatások meghatározására B.10. Mutagenitás-Kromoszóma-Rendellenesség in vitro vizsgálata emlősökön OECD 473 TG OECD 487 TG in vitro mikronukleusz vizsgálat emlős sejteken B.13/14. Mutagenitás: Reverz mutagenitási vizsgálat baktériumokkal OECD 471 TG B.18. DNS károsodás és –reparáció-nem tervezett DNS-szintészis (unscheduled DNA Synthesis, UDS) –emlős sejteken in vitro OECD 476 TG B.19. In vitro emlőssejt testvér-kromatid kicserélődés (sister chromatid exchange, SCE) vizsgálat OECD 479 TG B. 20. Nemhez kötött recesszív letális vizsgálat Drosophila melanogasteren OECD 477 TG

26 Azonos szakmai szabályok GLP= Good Laboratory Practice (Helyes Laboratóriumi Gyakorlat) ISO= International Organization for Standardization (Nemzetközi Szabványügyi Szervezet) Vizsgálati irányelvek OECD= Organisation for Economical Cooperation and Development (Gazdasági es Fejlesztési Együttműködési Szervezet) Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken OECD TG 473 vizsgálati irányelv szerint Célja: azon kémiai anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma károsodást okoznak emlős sejtekben.

27 A kromoszóma aberráció vizsgálat ismertetése  Sejtek Alkalmazható sejtvonalak jellemzői: stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita) jó növekedési képesség, rövid generációs idő, kariotípus stabilitás, állandó krom. szám. Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása. kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO, Puck1957)  Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (Ham’s F12).  Sejtvonalak ellenőrzése: Kariogram Kromoszóma szám Mikoplazma Spontán kromoszóma aberráció gyakoriság Történeti kontroll

28  Vizsgálati anyag előkészítése: kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás oldószer kiválasztása hígítási sor készítése stabilitás vizsgálat archiválás  Elő-kísérlet:  citotoxicitási vizsgálat MTT-assay (mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz enzim)  mitotikus index meghatározása MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya. A sejtpopuláció proliferációjának a mértékét jellemzi.  Koncentráció Legkevesebb három elemezhető koncentráció. Citotoxikus anyag esetén: va. az a koncentrációja amely a festék-redukciót 50%-kal csökkenti. Nem citotoxikus anyag esetén: va. 5 mg/ml v. 0,01M

29  Metabolikus aktiválás: S9 alkalmazása rágcsálók enziminducerrel (Arochlor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) kofaktorokkal kiegészítve (ADPH, glukóz-6-foszfát). S9 végkoncentráció 5-10% közötti. citokróm P450 enzim aktiválása. Indirekt mutagének kimutatására alkalmas Direkt-és indirekt-mutagén anyagok

30  Kontrollok: Metabolikus aktiválás nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C Metabolikus aktiválással: CP, Benz(a)pirén Oldószer: tápfolyadék, DMSO Archiválás  Kezelési idők : 4 óra +S9 4 óra -S9ÉRTÉKELÉS pozitív Negatív ismétlés24 óra -S9 48 óra -S9

31  Kolhicinezés: Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában. Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár százalékuk is blokkolt metafázisban található. A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.

32 Kromoszóma preparátum  Fénymikroszkópos értékelés kromatid típusú aberrációk:kromoszóma típusú aberrációk:delécióexchange

33 CHO sejt, kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO

34 CHO sejt, Deléció. Felvétel OKBI. MSBO

35 CHO sejt. Deléció. Felvétel: OKBI. MSBO 2000.

36 Humán limfocita. Kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO

37 Növekvő dózis Arzénmérgezés” Teratogenitás; neurotoxikus hatás Citotoxikus hatás (immuntoxicitás?) Hormon diszruptor hatás Glukokortikoid receptor gátlás Ösztrogén receptor gátlás Daganatkeltő hatás Géntoxicitás (oxidatív stressz) Repair gátlás (ligáz gátlás) Epigenetikus hatás (metiláció) A környezeti arzén-expozíció egészségkárosító hatásai

38 CHO-K1 (ATCC-CCL-61; Chinese hamster) Kínai hörcsög ovárium fibroblaszt Felvételek készültek: OKBI 2011 Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály Normál metafázis Kromoszóma aberráció Kromoszóma aberráció vizsgálat in vitro emlős sejteken OECD TG 473 Endomitózis Fragmentált kromoszómák

39 A testi sejtek kromoszómáiban a testvér-kromatidák közötti kicserélődés, reciprok DNS csere. Láthatóvá tehető, ha két sejtcikluson át bróm-dezoxi-uridinnel (timidin-analóg) jelöljük. Hoechst festés, majd UV kezelés, klasszikus Giemsa festés. Az SCE nem kromoszómaaberráció (Ctr. SCE 5). Az SCE már olyan kis vegyi mutagén-karcinogén expozíció kiváltja, amelyik még nem okoz krom. aberrációt. Alkalmazása primer prevencióban. B.19. IN VITRO EMLŐSSEJT TESTVÉR – KROMATID KICSERÉLŐDÉS (SISTER CHROMATID EXCHANGE, SCE) VIZSGÁLAT OECD TG 479

40 Az SCE indukcióban a repair folyamatok részvétele valószínű. A DNS repair deficiens congenitális defektusok esetében fokozott SCE indukáltság figyelhető meg az egészséges kontrollokhoz képest. pl.: Bloom szindróma Fanconi-anémia Werner sindróma xeroderma pigmentosum ataxia telangiectasia Dow kór

41 Ataxia telangiectasia (ATM) Rendkívül sokféle, sok szervet érintő tünet együttes sugár érzékenység és tumorok kialakulása

42 Bloom szindróma Kromoszóma instabilitás jellemzi Örökletes betegség, családi halmozódás 15q26.1, a BLM gén mutációja. Fokozott sister chromatid exchange (SCE) és spontán kromoszóma törékenység. DNS repair enzimek károsodása Jelentős mutagén túlérzékenység. a magasabb daganatképződési kockázat normál sejtBloom szindromás beteg sejt

43 In vitro mikronukleusz teszt OECD TG 487 Kromoszóma aberráció kimutatására alkalmas Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, olcsóbb, gyorsabb Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén mikronukleusz apoptózis

44 B. 18. Nem-tervezett DNS-szintézis (UDS) in vitro vizsgálata emlős májsejteken OECD TG 482 A vizsgálatokat az OKBI molekuláris és Sejtbiológiai Osztályán végezték. patkány primer májsejt Jelölések: * = sárga testszínű kerek, piros szemű hím kék = kezeletlen X kromoszóma piros = kezelt X kromoszóma nyíl = Y kromoszóma A nemhez kötött recesszív mutagenitási vizsgálat (Müller-5 teszt) elvi vázlata OECD TG Molinát és Vernolát gyomírtók repair-szintézist idukáló hatása primer patkánymájsejtben Egészségtudomány: 36, (1992) Kinoxalin származékok vizsgálata Népegészségügy 90 (1) (2012)

45 2012 ELTE


Letölteni ppt "KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály Budapest,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések