Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

In vitro sejtkultúrák használata a sejtműködés modellezésére: a műanyag előnyei és hátrányai Dr. Cervenak László Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "In vitro sejtkultúrák használata a sejtműködés modellezésére: a műanyag előnyei és hátrányai Dr. Cervenak László Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati."— Előadás másolata:

1 In vitro sejtkultúrák használata a sejtműködés modellezésére: a műanyag előnyei és hátrányai Dr. Cervenak László Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratórium Elméleti PhD Iskola Kurzusa- Molekulától a betegágyig, sejttől a szervezetig 2011/2012 Tanév

2 Miért kutatunk? Az élővilág (köztük az ember) jobb megismerése Betegségek kialakulásának megismerése A gyógyítás lehetőségeinek megismerése MEGISMERÉS

3 A megismerés szintjei In vivo: Élő szervezetben végrehajtott vizsgálat Ex vivo: A nemrég még élő szervezet egy szervének az élőn kívüli, általunk jobban kontrollált vizsgálata In vitro: A valaha élő szervezet egy szövetének, sejtjeinek vizsgálata, a szervezettől merőben eltérő körülmények között In silico: A fentiek adatainak felhasználásával, számítógép segítségével történő modellezés

4 A megismerés szintjei In vivoEx vivoIn vitroIn silico Relevancia Variabilitás Kivitelezhetőség Etikai problémák Költségek

5 In vitro sejtkultúrák Mi kell hozzá? Megfelelő sejt Sejttenyésztő tápfolyadék/táptalaj Sejttenyésztő edény Kontrollált körülmények – termosztát Kezeléshez sterilfülke (lamináris légáramlású) Hosszú távú tárolás (fagyasztás) In vitro sejtkultúrákhoz alkalmazkodó analitikai módszerek

6 Megfelelő sejt kiválasztása Eredet (organizmus, szerv, szövet) Primer izolátum vs. immortalizált sejtvonal Hozzáférhetőség (nem csak egyszeri…) Tenyészthetőség (egyszerű vagy körülményes) Irodalmi adatok az adott sejtről (0 – ) Tapasztalataink hasonló sejtekkel? Jó modellje-e a vizsgálandó folyamatnak? Fertőzési kockázat (a többi sejt/ kísérletező) ? ?

7 Tápfolyadék – médium Különböző komplettségi szintek Minimum: Izotóniás sóoldat, pufferelt, cukor Rövid távú kísérletek, ahol a fehérjék zavarhatnak Normál: Izotóniás sóoldat, aminosavak, vitaminok, nyomelemek, cukor, glutamin (tápanyagként), szérum (borjú, vagy ritkábban fajazonos), növekedési faktorok, indikátor Általános sejttenyésztés Speciális: Szérummentes, többféle hormonnal, szérumfehérjékkel kiegészített normál médium, de receptje ált. üzleti titok Speciális körülményeket igénylő sejtek, kísérletek

8 Tápfolyadék – médium DMEM KOMPONENSEK Inorganic Salts CaCl 2 Fe(NO 3 ) 3 9H 2 O MgSO 4 KCl NaHCO 3 NaCl NaH 2 PO 4 Amino Acids L-Arginine HCl L-Cysteine 2HCl L-Glutamine Glycine L-Histidine HCl H 2 O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine HCl L-Methionine L-Phenylalanine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine 2Na 2H 2 O L-Valine ADD L-Glutamine Vitamins Choline Chloride Folic Acid myo-Inositol Niacinamide D-Pantothenic Acid ˝Ca Pyridoxine HCl Riboflavin Thiamine HCl Other D-Glucose HEPES Phenol Red Na Pyruvic Acid Na Hank’s Balanced Salt Solution Inorganic Salts CaCl 2 2H 2 O MgSO 4 KCl KH 2 PO 4 NaHCO 3 NaCl Na 2 HPO 4 OTHER D-Glucose pH 4,0 7,4 9,0

9 Sejttenyésztő edény Feloszthatók Típus/forma Felület nagysága Felület formája Felület minősége Felhasználási terület szerint

10 Sejttenyésztő edény Petri-csésze Sokféle átmérővel, falmagassággal és felszínnel gyártják, de nem mind alkalmas sejttenyésztésre!!! Előnyök: egyszerű, olcsó, jó gázcsere, a sejtek jól kinyerhetőek belőle. Hátrányok: könnyebben befertőződik, óvatosan kell manipulálni.

11 Sejttenyésztő edény Flaska Sokféle felszínnel gyártják, a műanyag kémiai kezelése és bevonata is különbözhet. Lehet szűrős vagy zárt kupakkal. Előnyök: könnyebb sterilen tartani, manipulálni. Hátrányok: nehezebb a sejtekhez való hozzáférés, rosszabb gázcsere, drága

12 Sejttenyésztő edény Sejttenyésztő lemez (plate) Sokféle geometria, lyukszám, felület és bevonat, nem mind alkalmas sejttenyésztésre!!! Előnyök: Standard külső méretek miatt automatizált kezelés és analízis, egyszerű kezelhetőség, sokféle igényhez található megfelelő lemez Hátrányok: szisztematikus hiba lehetősége (széli hatás)

13 Sejttenyésztő edény Speciális tenyésztőedények Sejthozam növelés

14 Sejttenyésztő edény Speciális tenyésztőedények Analitikai fejlesztés

15 Sejttenyésztő edény Speciális tenyésztőedények Analitikai fejlesztés Transwell plate e-plate

16 Sejttenyésztő edény A felszín fontossága Kémiai kezelés FelszínSejt adhézió HidrofóbAlacsony Nemionos hidrofilNagyon alacsony Negatív hidrofilÁlt. jó-nagyon jó Pozitív hidrofilVáltozó SpeciálisSejtfüggő Biológiai bevonat ZselatinEndotél Poli-D-LysSimaizom Matrigel3D tenyészet

17 Kontrollált körülmények – termosztát Humán (ill. emlős, madár) sejtek esetén szabályozandó környezeti faktorok: Hőmérséklet (humán 37˚C, egér 38˚C, madarak ˚C) Páratartalom 100% CO 2 koncentráció általában 5% pH enyhén lúgos (7,2-7,4) A többi környezeti faktor stabilitását nem a termosztát, hanem a sejttenyésztő médium, ill. annak megfelelő cseréje biztosítja!

18 Hosszú távú tárolás (fagyasztás) Folyékony nitrogén vagy nitrogénnel hűtött tároló cél: víz üvegesedési hőmérsékleténél alacsonyabb hőmérséklet DMSO, glicerin – megakadályozzák az intracelluláris jégkristály képződést 1-2h tárolás -70˚C-on, majd áthelyezés a végleges tárolóba kontrollált hűtés: 1˚C/min (speciális fagyasztó) olvasztás gyorsan, csak 4-10˚C-ig, mert a krioprotektív adalékok mérgezők

19 Analitika

20

21 Előnyök - hátrányok Előnyök Jól standardizálható Nagy áteresztőképesség (sok minta kísérletenként) Statisztikai biztonság (sok párhuzamos kísérletenként) Kísérleti körülmények rugalmas megválasztása Nagy módszertani repertoár Egyszerűbb, lecsupaszított modellek (kevesebb változóval kell számolni) Más módszerekkel nem megválaszolható kérdések tisztázása Hátrányok Az in vivo szituációktól erősen el tud térni! Statikus (bár áramlási is egyre népszerűbb) Kevés sejt-sejt kapcsolat Nincs idegrendszeri szabályozás Nincs immunrendszer (ezért antibiotikumok alkalmazása általános) Hipoproteinémiás közeg Nagy kezdeti beruházást igényel

22 Köszönöm a figyelmet!


Letölteni ppt "In vitro sejtkultúrák használata a sejtműködés modellezésére: a műanyag előnyei és hátrányai Dr. Cervenak László Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati."

Hasonló előadás


Google Hirdetések