Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1 Klinikai genomika 2013.. 2 A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége (komplementer.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1 Klinikai genomika 2013.. 2 A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége (komplementer."— Előadás másolata:

1 1 Klinikai genomika 2013.

2 2 A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége (komplementer szálak hibridizációja) DNS-DNS, DNS- RNS, RNS-RNS kapcsolat

3 3 Restrikciós enzimek Restrikciós enzimek lehetővé teszik a DNS feldarabolását tompa vég ragadós vég

4 4 RFLP

5 5 SNP-RFLP;Southern blot Single nucleotid polymorphism (SNP) egy bázisnyi polimorfizmus

6 6 A témában a genetikai, majd genomikai kutatások száma 1990 után ugrott meg. Kary Mullis Nobel díj 1993 PCR, 1986 PCR készülék

7 7 Real time-PCR Valós idejű PCR- amplifikáció előrehaladtával arányosan erősödő fluoreszcencia – kvantitatív meghatározást tesz lehetővé

8 8 PCR-RFLP A vizsgált DNS szakaszt PCR-rel felamplifikáljuk A keletkezett terméket hasítjuk restrikciós enzimekkel Állapítsa meg az 1-5 személyek vércsoportját!

9 9 VNTR-marker VNTR-variable-number tandem repeats, kódoló, vagy nem-kódoló régióban is lehet A DNS mindenkiben előforduló két fix poziciója között egyedenként eltérő számú bázispár található VNTR-ek egyedi mintázatot mutatnak-DNS fingerprint VNTR lehet miniszatellit bp, mikroszatellit- 1-4bp, mikroszatellit a STR-short tandem repeat, és az SSR-single sequence repeat VNTR-RFLP

10 10 VNTR vizsgálat Kvantitatív fluoreszcens multiplex PCR A vizsgálat az STR/VNTR lókuszok hosszúságpolimorfizmusán alapszik Multiplex PCR-rel vizsgálják A PCR termékeket kapilláris elektroforézissel választják el.

11 11 Kapilláris (gél)elektroforézis A kapilláris gélelektroforézis a hagyományos gél-lap elektroforézis kapilláris elektroforézis megfelelője. Főbb előnye, hogy sokféle gél-mátrix használható – más az elválasztás (RNS, DNS, protein) 28S RNS 18S RNS 28S RNS létra Hibás futás

12 12 VNTR klinikai felhasználás Triplet repeat diseases (TRD) olyan betegségek, ahol a mutáns génben 3 bázisból álló DNS tripletek (pl. CCG) tandem ismétlődnek akár több százszor (pl. CCG CCG CCG CCG CCG). A vad típusú allél csak néhány triplet ismétlődést tartalmaz, míg a TRD mutánsban a repeat-ek száma felsokszorozódik és az így kialakuló mutáns gén nagy számú tandem triplet repeat-et tartalmaz pl. Huntington kór, < 28 normál tartomány; páciensben nem fejlődik ki a kór páciensben nem fejlődik ki kór, de a következő generáció veszélyeztetett néhány egyénben kifejlődik a betegség, de nem mindenkiben, a következő generáció is veszélyeztetett > 40 kifejlődik a Huntington kór További TRD betegségek: FragilisX (FMR1), spinobulbar muscular atrophy, Friedreich’s ataxia, spinocerebellar ataxia

13 13 Igazságügyi teszt DNS profil= az összes vizsgált kromoszóma marker genotípusa az adott egyedben Törvényszéki tesztek ált kromoszóma markert vizsgálnak Nem meghatározás: amelogenin polimorfizmus- amelogenin gén mind az X, mind az Y kromoszómán megtalálható, de az Y kromoszóma tartalmaz 6 olyan bázispárt, amit az X nem, ez alapján meghatározható a nem

14 14 2 marker a nemi kromoszómákra: fiú Méret marker (piros) Prenatális diagnosztika; fekete: 21 (és nemi); zöld: 13; kék: 18-as kromoszóma; ha 2 marker látszik minegyikből: nincsenek ilyen kromoszóma rendellenességei (99%)

15 15 3 db 21-es marker: 21- es triszómia Egy nemi marker: lány

16 16

17 17 Triploidia

18 18 A hólyagtumorok korai kimutatása FDA Cleared

19 19 Hólyagtumorok jelentősége USA: új beteg (2003), halál Kb beteg/USA betegnek van magas kockázata, hogy a betegség kiújuljon. Magyarország: 3-szor annyi férfi hal meg, mint nő Európában a rosszindulatú tumorok között az ötödik, USA-ban a negyedik leggyakoribb. Gyakorisága növekszik: becslések szerint 2010-re 28%-kal lesz magasabb az előfordulása

20 20 Kondas J, Szentgyorgyi E. Transurethral resection of 1250 bladder tumours Int Urol Nephrol. 1992;24(1): Magyarország: 1250 resectio után a recidiva aránya: 1 éven belül 23,8% 3 éven belül 36,6% 5 éves túlélési idő 66,5%

21 21 A hólyagrák diagnosztikájában jelenleg elterjedt és elérhető eszközök:Cystoscopia  0-2 évig:3 havonta  2-4 évig:6 havonta  5 év felett:évente Cytologia  a cystoscopiákkal egyidőben

22 22 A fluorescens in situ hybridizációs DNS teszt (FISH) alapjai Rövid DNS szakaszt (oligonukleotidot) fluorescens festékkel jelölnek. Ez az oligonukleotid komplementer a minta (a vizsgált) DNS (kromoszóma) egy szakaszához

23 23 Hibridizálás A denaturált (egyszállúsított) mintával összehozva a jelölt oligonukleotid felismeri a komplementer szakaszt és odaköt (hibridizál).

24 24 A fluorescens in situ hybridizációs DNS teszt (FISH)

25 25 Előkészítés >33 ml 73ºC

26 26 UroVysion próbák CEP 3 Spectrum Red  3-askromoszóma7-es kromoszóma9-es kromoszóma17-es kromoszóma CEP 7 Spectrum Green  LSI 9p21 Spectrum Gold  CEP 17 Spectrum Aqua  93 hólyagrákos és 86 normál betegen ellenőrizték a módszert

27 27 Normális és abnormális sejtmag összehasonlítása az optimalizált próbaszettel Normális Abnormális

28 28 UroVysion: Példák a lehetséges eltérésekre NormálAneuploid

29 29 Szekvenálás

30 30 Szekvenálás sebessége : 1. humán genom 2007: 2 hónap/1 humán genom: Roche (454 Life Sciences); 2010: 7 nap Illumina; 2013: 1 nap;

31 január: 2007 év módszere: szekvenálás

32 32 Humán genom szekvenálásának ára Hagyományos (Sanger) módszer HGP összköltsége: 3 milliárd $ 2001-ben átlagosan 10$/bázis: 2003: 300 millió $/ humán genom Új generációs szekvenálás: 2010: 7 nap Illumina; 10 ezer $ 2013: 1,000 $ Complete Genomics

33 33

34 34 Ion Proton: 149,000 $

35 35 NGS Exom-szekvenálás Célzott szekvenálás Bioinformatika

36 36 Microarray technológia Nukleotid láncok hibridizálásán alapuló nagy felbontású technológia Nukleotid próbákat kötnek szilárd hordozóra, ami lehet üveglapka-chip, illetve gyöngy Jelölt mintát hibridizálnak a próbákhoz Jel intenzitást mérnek

37 37

38 38 Comparative genome hybridization = CGH ArrayCGH = aCGH- genomiális DNS összehasonlítása microarray hibridizációval Hátrány: VOUS- variants of uncertain clinical significance Kiegyensúlyozott transzlokációk és alacsony szintű mozaicizmus nem vizsgálható

39 39 aCGH

40 40 aCGH klinikai felhasználása Betegség fókuszált array-k Hematológiai, onkológiai array-k Prenatális array-k Preimplantációs array-k

41 41 Már megszületett az első újszülött, akinek anyja korábban habituális vetélő volt, de a aCGH-val sikerült kiválasztani IVF-nél a megfelelő ivarsejteket. aCGH a fejlődési rendellenességek 12%- át tudta kimutatni, a hagyományos kariotipizálás 2%-át. 200$ többletköltség/beteg. VRONY= veleszületett Rendellenességek Országos nyílvántartása

42 42 Expressziós microarray mRNS expressziós szintek összehasonlítására alkalmas a vizsgált mintákban/csoportokban Komplex bioinformatikai elemzés jellemző (GSEA-gene set enrichment analízis, Pathway analízis) Felhasználás pl.mikrobiológia-gazda patogén kölcsönhatás vizsgálata, gyógyszerfejlesztés, gyógyszer hatásvizsgálat, biomarker keresés (tumor diagnosztika)

43 43

44 44 Fiktív eset: Fragilis-X-szindróma Egy 6 éves fiú ismeretlen eredetű középsúlyos értelmi fogyatékosság miatt került a gyermek-neurológiai szakrendelésre. Egyéb tünete nem volt, azonban arca jellegzetes: - hosszúkás arc - előreugró (erőteljes) állkapocs - nagy, elálló fülek. Fénykép: Erdélyi D

45 45 A FRAXA gén (17 exont tartalmaz) Exon 1 Exon 2 CGG-ismétlődés mRNS DNS CpG-szigetek CGG-ismétlődés: 5-44 (54):normális- egészséges, stabil 45-54:szürke zóna- egészséges, instabil :premutáció- egészséges ( * ), utódja beteg lehet :teljes mutáció- beteg vagy hordozó nő 5’-UTR kódoló szekvencia Exon 3 3’-UTR Erdélyi D

46 46 A fragilis-X-szindróma diagnosztikája Citogenetikai vizsgálat: folsav-hiányos tenyésztőfolyadék alkalmazásával megjelenő „töréspont” (ma már nem használják) PCR alapú vizsgálat (csak szűrővizsgálatként) Southern-blot alapú vizsgálat (jelenleg ezt tartjuk legalkalmasabbnak) Erdélyi D

47 47 Citogenetikai vizsgálat p q q27.3 Forrás: Fragile_X_chromosome.htm Hátránya: nagyon munkaigényes, soká ad eredményt sok az álnegatív és álpozitív lelet Erdélyi D

48 48 PCR- diagnosztika M Egészséges férfi 2.Egészséges nő 3.Egészséges nő (homozigóta) 4.Szürke zóna, nő 5.Full-mutációs férfi 6.Full-mutációs nő 7.Premutációs nő 8.Premutációs férfi Erdélyi D

49 49 Southern-blot vizsgálat Exon 1 EcoR I Eag I (metiláció-érzékeny: csak nem metilált szekvenciát hasít) izotóppal jelzett próba 2,8 Kb 5,2 Kb Erdélyi D metiláció történik (a.) normálisan nőkben az egyik X-kromoszóma inaktivációjakor, vagy (b.) kóros esetben nagyon nagyszámú CGG-ismétlődés miatt

50 50 1: Egészséges férfi: 2,8 Kb nem-metilált fragmentum. 2: Premutációs férfi: kissé hosszabb rövid Kb fragmentum. 3,4: Full-mutációs férfiak: jelentősen hosszabb hosszú fragmentum. 5: Egészséges nő: 5,2 Kb metilált és 2,8 Kb nem-metilált fragmentum. 6: Premutációs nő: kissé hosszabb rövid és 5.2 Kb fragmentum. 7,8: Full-mutációs nők: jelentősen hosszabb hosszú fragmentum. Forrás: Erdélyi D

51 51 Klinikai farmakogenomika

52 52 Jelentősége USA-ban évente legalább n halnak meg évente a felírt gyógyszerek mellékhatásai miatt. Európában a kórházi beutalások 10%-a a gyógyszer mellékhatások miatt van. A vérnyomás kezelésére használt  -blokkolók az emberek 30%-ában, az antidepresszánsok a kezeltek 50%-ában hatástalan. Mindezekért 60-80%-ban az emberek közötti genetikai különbségek felelősek.

53 53 Becslések szerint a piacon levő gyógyszerek 20%-ának hatását befolyásolja a lebontó enzimjének polimorfizmusa. Gyors metabolizmus: a gyógyszer túl gyorsan kiürül, nem éri el a hatásos szintet Lassú metabolizmus: a gyógyszer felhalmozódhat, fokozott mellékhatások

54 54 FDA honlap: rchAreas/Pharmacogenetics/ucm htm. rchAreas/Pharmacogenetics/ucm htm Jelenleg: 118 gyógyszer-kísérőben van genetikai infó A legtöbb itt található tétel az onkológiai (32 darab) és pszichiátriai (30 darab) betegségeket érinti. Összesen 60-szor valamilyen CYP gén variációi szerepelnek. CYP2D6 39-szer, a CYP2C19, 16-szor fordul elő.

55 55 Egy retrospektív felmérésben, amelyben 53 ezer beteget, és 99 az FDA javaslatára farmakogenetikai információval ellátott gyógyszert vizsgáltak, kimutatták, hogy súlyos mellékhatás lett volna elkerülhető, ha a javasolt farmakogenetikai tesztet elvégzik, és az eredménynek megfelelően járnak el.

56 56 Példák Succinylcholin: izomrelaxáns, kolinészteráz bontja le. 1/2500 emberben a butirilkolinészteráz (pszeudokolinészteráz) mindkét génje mutált: nem tudják lebontani a succinylcholint: hosszú izombénulás, apnoe (átmeneti légzésmegállás). Mercaptopurine: leukémiás, rákos gyermekek kezelése. Néhányan életveszélyes csontvelőkárosodást kaptak. Lebontóenzimje: tiopurin metiltranszferáz. 3 SNP- t találtak. Bármelyik is van, lassabb lebontás.

57 57 Leggyakoribb gyógyszer metabolizáló család Citokróm P450 (CYP) géncsalád. Májban termelődnek, és oxidálják az idegen kémiai anyagokat. 57 gén tartozik ide. Különösen jelentős: CYP2C19, CYP2D6, CYP2C9, CYP3A4, CYP3A5 Becslések szerint a súlyos gyógyszermellékhatások 80%-áért felelősek

58 58 Példák Kodein: fájdalom és köhögéscsillapító. A CYP2D6 alakítja át hatékony morfinná. Az emberek 10%-ában van egy polimorfizmus, ami miatt nem alakul át, így hatástalan.

59 59 Véralvadásgátló. A terápia elkezdése a legnagyobb arányú mellékhatással, és sürgősségi ellátással társul. Az USA-ban évente több mint 2 millióan kezdenek warfarin terápiába, közülük 20 % az első 6 hónapon belül kórházi ellátást igényel. A farmakogenomikai teszt bevezetésével ez 30%- kal csökkenthető. Célpont: VKOR (vitamin K 2,3-epoxide reductase), amelyet gátol. Lebontás: CYP2C9: lassan bontó variánsok Warfarin

60 60 Warfarin A VKORC1 (–1639G>A) polimorfizmusra heterozigóták 25%-kal, az AA homozigóták 50%-kal kevesebb warfarint igényelnek. Az egyének közötti dózis különbségek 12%- áért a CYP2C9, 25%-áért a VKOR gén polimorfizmusai a felelősek. Az FDA a két gén variációinak célzott tesztelését warfarin farmakogenetikai tesztként engedélyezte.

61 61

62 62 Személyi genomika. Pénzért (99$) mindenki számára hozzáférhető.

63 63 Köszönöm a figyelmet!


Letölteni ppt "1 Klinikai genomika 2013.. 2 A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége (komplementer."

Hasonló előadás


Google Hirdetések