Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea"— Előadás másolata:

1 STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea

2 Mutációk Mindig genetikai eredetű (környezeti vagy endogén hatás) Mindig genetikai eredetű (környezeti vagy endogén hatás) Minél több mutáció jön létre, annál nagyobb a rák kialakulásának valószínűsége Minél több mutáció jön létre, annál nagyobb a rák kialakulásának valószínűsége Sok vegyi anyag kis dózisban mutagén, nagy dózisban citotoxikus →genotoxikus anyagok Sok vegyi anyag kis dózisban mutagén, nagy dózisban citotoxikus →genotoxikus anyagok

3 Tautomerizáció Tautomerizáció

4 Fizikai tényezők: ionizáló és nem-ionizáló sugárzás Fizikai tényezők: ionizáló és nem-ionizáló sugárzás Ionizáló: rövid hullámhossz, atomokat ionokká alakítja → vízből szabadgyökök keletkeznek → intenzív oxidáció Ionizáló: rövid hullámhossz, atomokat ionokká alakítja → vízből szabadgyökök keletkeznek → intenzív oxidáció Determinisztikus (küszöbdózis) és sztochasztikus hatás (vagy kialakul, vagy nem, dózissal nő a valószínűség) Determinisztikus (küszöbdózis) és sztochasztikus hatás (vagy kialakul, vagy nem, dózissal nő a valószínűség) Nem-ionizáló: hosszú hullámhossz (pl. UV, timin dimerizáció) Nem-ionizáló: hosszú hullámhossz (pl. UV, timin dimerizáció) Mutagén tényezők

5 kémiai tényezők: kémiai tényezők: hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek (gyűrűs szerkezetű anyagok, beépülnek) hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek (gyűrűs szerkezetű anyagok, beépülnek) alkiláló vegyületek deamináló vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes párosodni, tranzíciót okoz

6 Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz pl. salétromossav citozin → uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranzíciót okoz

7 Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl.etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

8 Környezeti mutagén anyagok élelmiszeradalékok: nitritek, nitritek,nitrátoknátriumbisziulfitciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H2O2femnilén-diamindiaminotoluoldiaminoanizol gyógyszerek: citosztatikumok altató és nyugtató szer fertőtlenítőszerek (formaldehid, H 2 O 2 ) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidoketilén-iminekacetaldehidAkrilaldehid propán szulfon Dimetil-szulfátDietil-szulfátdimetil-nitrózaminhidrazinokuretánEtilén-kloridVinil-klorid Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémekazbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

9 STTA ( stable transfected transcriptional activation assay) Endokrin diszruptorok azonosítására Endokrin diszruptorok azonosítására OECD 455 guideline OECD 455 guideline Hormonreceptorok citoplazmában Hormonreceptorok citoplazmában Szubsztrát kötődés Szubsztrát kötődés Dimerizáció és aktiválódás Dimerizáció és aktiválódás Receptor-ligand komplex DNS promóterhez kötődik → transzkripció aktiválása Receptor-ligand komplex DNS promóterhez kötődik → transzkripció aktiválása

10 STTA assay-ben: hERα-HeLa-9903 sejtvonal hERα-HeLa-9903 sejtvonal Legrégebbi humán sejtvonal Legrégebbi humán sejtvonal Méhnyakrákból származik (Henrietta Lacks) Méhnyakrákból származik (Henrietta Lacks) HeLa genetikailag módosított változata → ösztrogén reszponzív elemek, ösztrogén receptor HeLa genetikailag módosított változata → ösztrogén reszponzív elemek, ösztrogén receptor

11 DNS-ben szintetikus promóter kötőhellyel DNS-ben szintetikus promóter kötőhellyel Promóter után luciferáz gén → hormon hatású anyag kötődése esetén átíródik Promóter után luciferáz gén → hormon hatású anyag kötődése esetén átíródik Szubsztrát (luciferin) hozzáadása Szubsztrát (luciferin) hozzáadása Fény szabadul fel, amit mérni lehet (luminométer) Fény szabadul fel, amit mérni lehet (luminométer) Minél nagyobb a fény aktivitása, annál nagyobb a hormonreceptor hatás (1 μM határig) Minél nagyobb a fény aktivitása, annál nagyobb a hormonreceptor hatás (1 μM határig) Pozitív és negatív referencia anyagok (határokon belül!) Pozitív és negatív referencia anyagok (határokon belül!) Pozitív és negatív kontroll Pozitív és negatív kontroll

12 HR: Hormon Receptor hER: humán ösztrogén receptor ERE:Estrogen-Responsive Element ligandum HR 5’ 3’ luciferáz fény 5’ 3’ sejtmag citoplazma Luciferáz aktivitás M dimerizáció ERE luciferáz ERE Full length of hER hERhER Luciferin- luciferáz reakcó vegyület

13 Bruce Ames 1970-es évek elején Bruce Ames 1970-es évek elején Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas (genetikai betegségek) Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas (genetikai betegségek) Prokarióta sejtek Prokarióta sejtek Aminosav szintetizáló képesség károsodott Aminosav szintetizáló képesség károsodott Öröklött génmutáció reverziója Öröklött génmutáció reverziója A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció) A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció) Minél több mutációt okoz egy anyag, annál valószínűbb, hogy pont az a triplet mutálódik Minél több mutációt okoz egy anyag, annál valószínűbb, hogy pont az a triplet mutálódik Bakteriális reverz mutagenitási vizsgálat

14 Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) Metabolikus aktivizálás kívülről Metabolikus aktivizálás kívülről Citokróm P450 oxidációs rendszer (májban) Citokróm P450 oxidációs rendszer (májban) S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok Enzim termelődésének növelése → inducer Enzim termelődésének növelése → inducer Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll) Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll)

15 Teszttörzsek Escherichia coli és Salmonella typhimurium Escherichia coli és Salmonella typhimurium E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), S. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, TA100, TA1535, TA1537) Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek Negatív és pozitív kontroll kell Negatív és pozitív kontroll kell

16 Egyéb genetikai módosítások Cél az érzékenység növelése Cél az érzékenység növelése Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia Törzsek ellenőrzése szükséges Törzsek ellenőrzése szükséges

17 Előinkubációs és lemezöntéses módszer Előinkubációs és lemezöntéses módszer Speciális anyagoknál módosítások Speciális anyagoknál módosítások

18 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar Minimál agaros Petri-csészére önteni Minimál agaros Petri-csészére önteni Top agar megszilárdulása Top agar megszilárdulása Inkubálás óráig 37°C-on Inkubálás óráig 37°C-on Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje perc) Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje perc) Telepszámolás, mikroszkópos értékelés Telepszámolás, mikroszkópos értékelés Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés) Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés) A vizsgálat menete

19 Aminosav igény ellenőrzése (minimál agar) Ampicillin rezisztencia, kristályibolya- és UV-érzékenység (tápagar) Spontán mutáció (negatív kontroll)Indukált mutáció (pozitív kontroll)

20 Negatív kontroll, normál baktériumpázsit 25μg/lemez glutáraldehid toxikus hatása

21 Ames II. módosított Ames vizsgálat módosított Ames vizsgálat 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.) TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.) baktériumok és teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) baktériumok és teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) automatizált, kisebb mennyiség is elég automatizált, kisebb mennyiség is elég

22 In vivo mikronukleusz Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben OECD Guideline 474 OECD Guideline 474 (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz

23 A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése Normocita →polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Normocita →polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk A mikronukleusszal rendelkező eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal A mikronukleusszal rendelkező eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal

24 Állatok kezelése subcutan (bőr alatt) vagy per os (szájon át) Állatok kezelése subcutan (bőr alatt) vagy per os (szájon át) Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal Kezelés egyszer → leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) Kezelés egyszer → leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) Femur preparálás → csontvelő fötális borjúsavóba → centrifugálás → kenetkészítés Femur preparálás → csontvelő fötális borjúsavóba → centrifugálás → kenetkészítés

25 Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Normocita Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal és anélkül Egy polikromáziás eritrocita az érett eritrociták között

26 Értékelés mikroszkóppal Értékelés mikroszkóppal Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány Statisztikai értékelés Statisztikai értékelés


Letölteni ppt "STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea"

Hasonló előadás


Google Hirdetések