Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Genotoxicitás Mutagén hatások Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea Országos Kémiai Biztonsági Intézet 2011. 11. 17.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Genotoxicitás Mutagén hatások Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea Országos Kémiai Biztonsági Intézet 2011. 11. 17."— Előadás másolata:

1 Genotoxicitás Mutagén hatások Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea Országos Kémiai Biztonsági Intézet

2 A genotoxikológia az emberrel közvetlenül kapcsolatba kerülő anyagok mutagén hatását vizsgálja. A genotoxikológia az emberrel közvetlenül kapcsolatba kerülő anyagok mutagén hatását vizsgálja. Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják. Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják. Mutáció: Egy tulajdonság egy nemzedéken belül ugrásszerűen, és öröklődő módon megváltozik. Mutáció: Egy tulajdonság egy nemzedéken belül ugrásszerűen, és öröklődő módon megváltozik.

3 Mutációk csoportosítása eredetük szerint: Mutációk csoportosítása eredetük szerint: spontán mutáció: természetes körülmények közt minden fajra jellemző gyakorisággal lép fel. Prokariótáknál nagyobb, mint az eukariótáknál spontán mutáció: természetes körülmények közt minden fajra jellemző gyakorisággal lép fel. Prokariótáknál nagyobb, mint az eukariótáknál pl. tautomerizáció, spontán deamináció indukált mutáció: környezeti hatásra létrejövő ill. kísérleti körülmények között kiváltott mutációk. indukált mutáció: környezeti hatásra létrejövő ill. kísérleti körülmények között kiváltott mutációk. Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint: Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint: szomatikus szomatikus germinális germinális Mutációk csoportosítás a hatópont szerint: Mutációk csoportosítás a hatópont szerint: gén- v. pontmutációk gén- v. pontmutációk Tranzíció: purin-purin vagy pirimidin-pirimidin csere (A →G, G →A vagy T→C, C →T) Tranzíció: purin-purin vagy pirimidin-pirimidin csere (A →G, G →A vagy T→C, C →T) Transzverzió: purin-pirimidin vagy pirimidin-purin csere (A →T, A →C, G →T, G →C vagy T →A, T →G, C →A, C →G) Transzverzió: purin-pirimidin vagy pirimidin-purin csere (A →T, A →C, G →T, G →C vagy T →A, T →G, C →A, C →G) Inszerció, deléció: Egy vagy két bázis betoldása vagy kiesése (olvasási keret megváltozása) Inszerció, deléció: Egy vagy két bázis betoldása vagy kiesése (olvasási keret megváltozása) kromoszóma mutációk kromoszóma mutációk

4  Pontmutáció hatása a géntermékre : csendes mutáció: A triplet utolsó bázisa változik, de ugyanazt kódolja. AGT (Ser) → AGC (Ser) semleges mutáció: A kódolt aminosav hasonló jellegűre változik, ezért a fehérje szerkezetét és funkcióját nem feltétlenül érinti. AAA (Lys bázikus) → AGA (Arg bázikus) misszensz mutáció: Egy báziscsere miatt másik nem funkcióképes aminosav kódja keletkezik.GAG (Glu savas) → GTG (Val semleges) nonszensz mutáció: Egy báziscsere miatt STOP kód keletkezik. TAC (Tyr) → TAG (Stop) kereteltolódási mutáció (frameshift): Egy vagy két bázis kiesése vagy hozzáadódása miatt elcsúszik a leolvasási keret. A

5 Bázis tautomerizáció (spontán m.) A guanin enol formája timinnel, az adenin imino formája pedig citozinnal képes H-híd kialakítására. A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására. A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és állandósul Guanin és timin keto formában Adenin és citozin amino formában

6 sugárzás (röntgen, ultraibolya, radioizotópok) molekulákat gerjesztik és ionizálják, sejtben sok vízmolekula → szabadgyökök sugárzás (röntgen, ultraibolya, radioizotópok) molekulákat gerjesztik és ionizálják, sejtben sok vízmolekula → szabadgyökök kémiai anyagok: kémiai anyagok: hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek alkiláló vegyületek deamináló vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek alkiláló vegyületek deamináló vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok Mutagén tényezők

7 Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes párosodni, tranzíciót okoz Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz (aminocsoport →oxocsoport) Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz (aminocsoport →oxocsoport) pl. salétromossav citozin → uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranzíciót okoz

8 Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl.etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

9 Környezeti mutagén anyagok Környezeti mutagén anyagok élelmiszeradalékok: nitriteknitrátoknátriumbisziulfitciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H 2 O 2 femnilén-diamindiaminotoluoldiaminoanizol gyógyszerek: citosztatikumok altató és nyugtató szer fertőtlenítőszerek (formaldehid, H 2 O 2 ) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidoketilén-iminekacetaldehidakrilaldehidPropán-szulfonDimetil-szulfátDietil-szulfátdimetil-nitrózaminhidrazinokuretánEtilén-kloridVinil-klorid Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémekazbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

10 Bruce Ames 1970-es évek elején Bruce Ames 1970-es évek elején Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas Daganatos betegségek, fertilitási problémák, genetikai betegségek (pl. albinizmus) Daganatos betegségek, fertilitási problémák, genetikai betegségek (pl. albinizmus) Mutáns prokarióta sejtek (Escherichia coli és Salmonella typhimurium) Mutáns prokarióta sejtek (Escherichia coli és Salmonella typhimurium) Aminosav szintetizáló képesség károsodott Aminosav szintetizáló képesség károsodott A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció vagy reverzió) A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció vagy reverzió) Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll) Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll) Bakteriális reverz mutagenitási vizsgálat

11 Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) Metabolikus aktivizálás kívülről Metabolikus aktivizálás kívülről Citokróm P450 metabolikus oxidációs rendszer Citokróm P450 metabolikus oxidációs rendszer Kísérleti állatok kezelése Kísérleti állatok kezelése Enzim termelődésének növelése → inducer Enzim termelődésének növelése → inducer S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) Előinkubációs és lemezöntéses módszer Előinkubációs és lemezöntéses módszer Speciális anyagoknál módosítások Speciális anyagoknál módosítások

12 Teszttörzsek E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), S. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, TA100, TA1535, TA1537) Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) Hisztidin és triptofán mentes táptalajon inkubálás Hisztidin és triptofán mentes táptalajon inkubálás Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek Negatív és pozitív kontroll kell Negatív és pozitív kontroll kell

13 Egyéb genetikai módosítások Cél az érzékenység növelése Cél az érzékenység növelése Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása (ellenőrzés kristályibolyával) Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása (ellenőrzés kristályibolyával) uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia Törzsek ellenőrzése szükséges Törzsek ellenőrzése szükséges

14 T ö rzs Mut á ci ó g é nje Mut á ci ó t í pusa DNS-repairLPSPlazmid TA98hisDFrameshiftuvrBrfapKM101 TA100hisG B á zisp á r szubsztit ú ci ó uvrBrfapKM101 TA1535hisG B á zisp á r szubsztit ú ci ó uvrBrfa- TA1537hisCFrameshiftuvrBrfa- WP2 uvrA trp B á zisp á r szubsztit ú ci ó uvrA-- Alkalmazott törzsek genotípusa

15 TA98TA100TA1535TA1537 WP2 uvrA Hisztidin sz ü ks é glet Triptof á n sz ü ks é glet Krist á lyibolya é rz é kenys é g UV é rz é kenys é g Ampicillinrezisztencia++--- Spont á n revert á nsok Alkalmazott törzsek fenotípusa

16 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar Minimál agaros Petri-csészére önteni Minimál agaros Petri-csészére önteni Top agar megszilárdulása Top agar megszilárdulása Inkubálás óráig 37°C-on Inkubálás óráig 37°C-on Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje perc) Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje perc) Telepszámolás, mikroszkópos értékelés Telepszámolás, mikroszkópos értékelés Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés) Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés) A vizsgálat menete

17 (Mutagén anyag vizsgálata)

18 Aminosav igény ellenőrzése (minimál agar) Ampicillin rezisztencia, kristályibolya- és UV-érzékenység (tápagar) Spontán mutáció (negatív kontroll) Indukált mutáció (pozitív kontroll) A fényképek az OKBI MSBO laboratóriumában készültek 2011-ben.

19 Negatív kontroll, normál baktériumpázsit 25μg/lemez glutáraldehid toxikus hatása toxikus hatása A fényképek az OKBI MSBO laboratóriumában készültek 2011-ben.

20 Ames II. módosított Ames vizsgálat módosított Ames vizsgálat 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.) TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.) baktériumok + teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) baktériumok + teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) automatizált, kisebb mennyiség is elég automatizált, kisebb mennyiség is elég

21 In vivo mikronukleusz Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben OECD Guideline 474 OECD Guideline 474 (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz

22 A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése Normoblast →polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Normoblast →polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk A mikronukleusszal rendelkező polikromáziás eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal A mikronukleusszal rendelkező polikromáziás eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal

23 Állatok kezelése intraperitoneálisan vagy per os (szájon át) Állatok kezelése intraperitoneálisan vagy per os (szájon át) Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport (több dózis, hím és nőstény állatok) Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport (több dózis, hím és nőstény állatok) Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal Kezelés egyszer → leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) Kezelés egyszer → leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) Femur preparálás → csontvelő fötális borjúsavóba → centrifugálás → kenetkészítés Femur preparálás → csontvelő fötális borjúsavóba → centrifugálás → kenetkészítés

24 Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal és anélkül Egy polikromáziás eritrocita az érett eritrociták (normociták) között

25 Értékelés mikroszkóppal Értékelés mikroszkóppal Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány Statisztikai értékelés Statisztikai értékelés


Letölteni ppt "Genotoxicitás Mutagén hatások Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea Országos Kémiai Biztonsági Intézet 2011. 11. 17."

Hasonló előadás


Google Hirdetések