IMMOBILIZÁLÁS Mikroorganizmusok, sejtek, enzimek

Az előadások a következő témára: "IMMOBILIZÁLÁS Mikroorganizmusok, sejtek, enzimek"— Előadás másolata:

1 IMMOBILIZÁLÁS Mikroorganizmusok, sejtek, enzimek
felületi rögzítése hordozón polimerekbe zárása keresztkötése

2 Immobilizáció a sejtek kötődésének vagy bezárásának különböző formáit összefoglaló fogalom A természetben gyakran találkozunk vele - legtöbb sejt életciklusa bizonyos fázisában igyekszik helyhez kötődni Élő sejtek polimer gélbe zárását először 1969-ben Updike és mtsai írták le Tudományos és ipari jelentőség: pl. aminosavak, szerves savak, antibiotikumok, szteroidok, enzimek előállítása Környezeti alkalmazásuk is egyre jobban terjed

3 Előnyök Védjük a rögzített sejteket a külső behatásoktól, valamint megakadályozzuk eltávozásukat a reakciótérből Állati és növényi sejteket, szöveteket is lehet immobilizálni Számos biokatalitikus rendszer számára előnyös Javul a metabolikus aktivitása a sejteknek Plazmid stabilitás nő Kisebb a fertőzés veszélye könnyebben tárolható Hátrányok A szaporodó sejtek kiszabadulhatnak az immobilizáló anyagból, ha szétfeszítik azt A diffúziós barrier a mátrix, vagy a nagy sejtsűrűség miatt növekedhet Aerob rdsz-knél az oxigénhez gátolt lehet a hozzáférés

4 Milyen paramétereknek kell megfelelnie egy jó hordozónak:
Nem-toxikus Nem szennyező Jó minőségű, hosszú élettartam Biztosított legyen a sejtaktivitás és denzitás Biztosított legyen a sejtek kijutása a célhelyre (ha szükséges) Hordozók Természetes és szintetikus polimerek: agar, agaróz, poliakrilamid alginát, karragenan, polisztirén cellulóz, kollagén, stb poliuretán Egyéb: üveg, kerámia, agyag, apatit, alginit, ioncserélő gyanták

5 Immobilizálási stratégiák
felületi adszorpció bezárás a: encapsulation b: entrapment keresztkötés biofilm képzés aggregátum képzés, flokkuláció hordozóhoz kötés (ionos, kovalens) 1. 2. a, b, 3. 4., 5. 6.

6 A sejtek a szilárd felszínhez egy/több fehérjén keresztül kapcsolódnak
Lpp = lipoprotein OmpA = outer membrane protein A AmCyan = cyan-fluorescent protein

7 Alginát Barna algából nyerik
Lineáris poliszaharid, b-D-mannuronát (M) és a-L-guluronát (G), kötések Homopolimer blokkok (G-, M-blokk) ill és vegyes blokkok (GM blokk) random szerveződnek (az alginát eredetétől függően egyedi szerkezet/felépítés) G-blokk divalens kationokkal (Ca2+, Ba2+, stb) stabil keresztkötéseket hoz létre, ennek köszönhető, hogy immobilizáláshoz használni tudjuk Több G-blokk esetén erősebb, rigidebb gélt kapunk és kisebb porusméreteket, több M-blokk esetén lágyabb a gél és nagyobb porusméreteket találunk A gélesedés nem hőmérséklet függő Keresztkötött G frakciót jelöli Gélesedési zóna M frakciót jelképezi

8 Alginát gélágy kialakítása
Egyszerű, sejt- és környezetbarát módszer Idegen mikróbák tápanyagok Alginát burok Metabolitok, anyagcsere termékek sejtszuszpenzió Alginát oldat CaCl2 oldat sejtek

9 karrageenan Vörös algák termelik 3 típus: i-, l-, k-karrageenan
Nagyon sokféle forma, de az alapváz közös: b(1,3)-D-galaktóz és a(1,4)-D-galaktóz molekulák váltják egymást, viszont eltérnek abban, hogy a két cukor hol szulfonált és mennyi szulfoncsoportot tartalmaz A gélesedés hőmérséklet függő folyamat, K+ ionok jelenlétében Hátránya, hogy a gélesedéshez legalább 40°C szükséges, mely az immobilizálandó mikrobák többségének kedvezőtlen melegítés hűtés

10 Gelrite Természetes anionos poliszaharid, glükuronsav, rhamnóz és glükóz alegységekből épül fel rigid, agarszerű gélt képez elsősorban kétértékű kationok jelenlétében hőstabil

11 Kitozán Kationos polimer, D-glükóz-amin egységekből épül fel
Legtöbb savban, főleg szerves savakban oldható Nem toxikus, lebontható Kozmetikai, orvosi, élelmiszeripari jelentősége is van

12 ciklodextrin A ciklodextrin keményítőből előállítható, belül üreges, henger alakú molekula, amelybe, mint egy kapszulába, bezárhatók más anyagok molekulái. A keményítőben a kötéseket a térállású OH-csoportok hozzák létre, minden kötés ugyanolyan irányba fordul, ezért a keményítő molekulája úgy csavarodik, mint egy spirálrugó, vagyis hélixszerkezetű. A Bacillus macerans (és néhány egyéb mikro-organizmus) által termelt enzim ezt a hélix szer-kezetet úgy hasítja el egyszerre két helyen, hogy egyúttal össze is zárja a keletkező két szabad vég-csoportot, s így alakul ki a ciklodextrin-szerkezet. E molekuláris „csomagolóanyag” lehetővé teszi, hogy új, a meglevőknél hatékonyabb gyógyszereket gyártsunk. környezeti alkalmazhatósága is bizonyított, mivel immobilizálja a szennyeződéseket, vagy akár a remediációhoz használandó mikrobákat alfa-ciklodextrin (a hidrogénatomokat zöld, az oxigént piros, a szenet szürke színű gömbök jelölik)

13 Poliakrilamid Az akrilamid gyökképző (ammónium perszulfát) hatására lineáris polimert képez, s ezt a polimerizációs folyamatot katalizátorral (TEMED) lehet gyorsítani. A térhálós polimer szerkezet kialakítása bis-akrilamid alkalmazásával oldható meg. Ilyen térhálós szerkezet nemcsak makromolekulák, fehérjék, nukleinsavak elválasztását, de immobilizálását is lehetővé teszi. kaolin agyag polyacrylamide ‘híddal’ metastabil szerkezetet hoz létre (SEM image)

14 Polisztirol Polisztirollal mindenhol találkozunk környezetünkben
A polisztirol a sztirol polimerizációs terméke, policiklusos aromás szénhidrogén. a sztirol a kőolaj feldolgozás egyik mellék-terméke, normál hőmérsékleten meg-lehetősen állandó (az Egészségügyi Világ-szervezet (WHO) szabványa szerint azonban mérgező, és rákkeltőként is figyelembe kell venni). Könnyen polimerizálódik A polisztirol ellenáll a savaknak, lúgoknak, de a legtöbb szerves oldószer megtámadja, és érzékeny a fényre is. Az 1930-as évektől használják intenzíven, először szintetikus gumit állítottak elő belőle

15 Poliuretán A B A poliuretán (PUR) csaknem korlátlan lehetőségekkel bíró termoplasztikus műanyag. Régóta alkotóeleme mindennapi életünknek. Két, speciális receptúra szerint előállított komponensből (A - poliol, B - izocianát) áll, melyből az adalékok mennyisége és minősége, valamint a komponensek keverési aránya alapján kemény, félkemény és lágy habanyagok, öntőmasszák, lágy vagy kemény elasztomerek gyárthatók a legkülönbözőbb felhasználási célokra.

16 Bioremediációs alkalmazások
Fontos szempontok: produktivitás stabilitás az alkalmazás során stabilitás a tárolás során érzékenység a szennyezőanyagokra egyszerű/összetett biztonság előnyök/hátrányok Szennyvíz tisztítás, talaj remediáció, biofilm, bioreaktorok,

17 Biodegradáció immobilizált sejtekkel és enzimekkel példák
Szerves-foszfát peszticidek bontása: Pseudomonas diminuta - foszfotriészteráz enzim széles szubsztrát specifitás paraoxon hidrolizis: immobilizálás: (porózus szilikagélre), tritil agaróz egyszerű eljárás fix-ágyas csőreaktor szubsztrát pumpa bioreaktor detektor gyűjtőtartály UV/VIS

18 Herbicidek bontására példa:
glifozát széles spektrumú herbicid, előszeretettel alkalmazzák (Monsanto szennyvízkezelés szükségessé vált) pilot plant: kovaföldre immobilizált mikroba konzorcium H2SO4 Szennyvíz tározótó bioreaktor Tápanyag tank levegő Kiegyenlítő

19 Fenolos hulladékok bontása. Fusarium flocciferum
Fenolos hulladékok bontása Fusarium flocciferum poliuretán + felületaktív anyag 1 g/L fenol koncentráció mellett négy hónap alatt teljesen elbontja Pentaklórfenol bontása Arthrobacter sp. koimmobilizált rendszer: a baktériumot aktív szénre rögzíti, majd alginát oldatba adagolja (egyéb hordozókat is vizsgáltak) gélmembrán A kapszula belsejében Az adszorbens és a sejtek levegő CO2 csapda elhasznált Fontos paraméterek: az adszorbens mennyisége, az alginát gél porozitása, segíti a PCP adszorbciót és mineralizációt felületaktív anyag jelenléte

20 PCP bontása Arthrobacter-rel

21 Alginát gélbe zárt, CP bontásban élenjáró baktériumok összehasonlítása
baktériumok: Pseudomonas putida, Pseudomonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter 10 mg/L CP – free c. 50 mg/L CP – free c. 10 mg/L CP – imm. c. 50 mg/L CP – imm. c. 3 4 2 1 5 mg/L CP – free c. 10 mg/L CP – free c. 50 mg/L CP – free c. 5 mg/L CP – imm. c. 10 mg/L CP – imm. c. 50 mg/L CP – imm. c. 3 1 2 6 4 5 5 mg/L CP – free c. 50 mg/L CP – free c. 5 mg/L CP – imm. c. 50 mg/L CP – imm. c. 1 2 4 3

22 Fenol bontás kevert kultúrával üveglapra kolloid szilika oldatba kevert mikroorganizmusok rögzítése, a rögzült rétegre újabb szilika réteget visznek.

23 p-nitrofenol (PNP) bontása peszticid és gyógyszergyártásban fordul elő Pseudomonas sp. 8 törzs együttesen (P. putida, P. fluorescens, P. mendonica) Kovaföld hordozó, oszlop bioreaktor, levegőztetett a rögzített sejtek képesek tolerálni az 1800 mg/L PNP konc. is! Poliklórozott bifenilek bontása két Pseudomonas faj és egy Alcaligenes faj ko-kultúrában bont kevert PCB-t, három féle hordozón

24

25 Morfolin bontás Mycobacterium aurum-mal (G+ baktérium) morfolin = 1,4 – tetrahidro – oxazin (heterociklusos vegyület: C4H9NO) származékai: adalékanyagok, oldószerek, antioxidáns anyagok, stb. gyártásuk során az effluensben morfolin jelenik meg, ezért fontos lebontásának kidolgozása

26 Nikkel - ötvözet szálakon létrehozott Thiobacillus ferrooxidans biofilm vas-szulfát oxidációja - acidofil, aerob kemolitotróf baktérium - extrém alacsony pH (< 2,0) a vas(III)szulfát kicsapódásának elkerülése érdekében - a baktérium igyekszik hozzátapadni szilárd felszínhez, így nem könnyen mosódik ki

27 Higany biotranszformáció fluid-ágyas bioreaktorban - különösen a szerves higany vegyületek veszélyesek, bár ipari és mezőgazdasági felhasználása ma már korlátozott, de tartósan ott maradt a környezetben, - ivóvízben < 1μg/L a max. megengedett konc. - mikrobiálisan az oxidációs állapot változtatható, illetve a szerves higany vegyületek átalakíthatók (az elemi higany kevésbé toxikus) - pl. Aeromonas hydrophilia – kofaktor függő higany reduktáz rendszere szilika és aluminium porózus hordozóra rögzítve, de több probléma is volt, pl. az elemi higany akkumulálódott, nem távozott el. Levegőztetéssel némileg javult, és a gőztérből kihajtották a Hg-t, melyet kondenzáltak, majd reciklizálták - a problémák kiküszöbölésére új rendszer Pseudomonas putida KT2442, random mutagenezissel létrehoztak egy Hg(II) redukáló törzset (első próba polivinil alkohol hidrogélbe) - alginát gélbe ágyazott sejtekkel igen jó eredmények folyamatos rendszerben

28 Kadmium eltávolítása bioszorbens segítségével - abból indultak ki, hogy a poliszaharidok kötődnek fémekhez ezt a tulajdonságot fordították meg, kadmiumot a cukor polimerhez alginát, mint szorbens megfelelő volt air-lift reaktorban kivitelezve - a telítődött szorbensből megfelelő eljárással kivonható a kadmium

29 Kevesebb belépő kadmium esetén a szorpció hatékonyabb
Flow rate: 2 dm3/min Flow rate: 4 dm3/min Kevesebb belépő kadmium esetén a szorpció hatékonyabb Emelt szorbens koncentráció mellett szintén kevesebb az effluens kadmium tartalma A szorbens porozitása szintén befolyásolja a kötődés hatékonyságát

30 Felületaktív anyag bontása alginát/pektát gélbe immobilizilált Comamonas terrigena baktériummal - vegyipar, gyógyszeripar, élelmiszeripar használja - negatívan hat a mikrobiális életre, mivel megbontja a membrán stabilitását, habzik befolyásolva az oxigén diffúziót (bizonyos esetekben előnyös a jelenlétük olajbontás) - gélágyba immobilizálva a sejteket megvédjük a káros hatásoktól konkrét példa: anion aktív anyag – dihexilszulfoszukcinát (DHSS) alginát/pektát kevert gélágyban Comamonas terrigena