Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

The project is co-financed by the European Union www.hu-srb-ipa.com Projekat sufinansira Evropska Unija A projekt az Európai Unió társfinszírozásával valósul.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "The project is co-financed by the European Union www.hu-srb-ipa.com Projekat sufinansira Evropska Unija A projekt az Európai Unió társfinszírozásával valósul."— Előadás másolata:

1 The project is co-financed by the European Union Projekat sufinansira Evropska Unija A projekt az Európai Unió társfinszírozásával valósul meg University of Novi Sad, Faculty of Technology Novi Sad, Serbia Univerzitet u Novom Sadu, Tehnološki fakultet Novi Sad, Srbija Újvidéki Egyetem, Technológiai Kar LACREMED Analytical methods for xenobiotics determination developed within the LACREMED projectGuideline Analitičke metode za određivanje ksenobiotika razvijene u okviru LACREMED projektuSmernice Development of an enzymological (laccase-based) remediation product and technology HUSRB/1002/214/147 A LACREMED projekten belül kifejlesz t ett, xenobiotikumok meghatározására szolgáló analitikai módszerekÚtmutató Razvoj proizvoda i tehnologije za remedijaciju na bazi primene enzima (lakaze) Enzim- (lakkáz-) alapú bioremediációs termék és technológia kifejlesztése

2 LACREMED Guideline on analytical methods developed in The extensive use of pesticides in the agriculture and the additional environmental pollution caused by industrial emission during their production has resulted in the occurrence of residues of these chemicals and their metabolites in food commodities, water and soil. In order to be able to monitor their presence, there is a need for highly specific, selective and sensitive multiresidue analytical method that can ensure the reliable data on the occurrence of the parent components and their metabolites in various kind of samples. In the very core of the IPA CBC HU-SRB LACREMED project (HUSRB/1002/214/147), aiming to develop the innovative approach for remediation of soils and water polluted with pesticides and their metabolites, is development of a robust analytical method for simultaneous determination of derivates of phenoligenic and anilogenic pesticides, known for their toxicity and wide spread. This guideline summarizes the parameters of the method developed in the LACREMED project based on the advanced instrumental technique available at the Faculty of Technology Novi Sad, Serbia, giving also a brief intro on the pesticides presence in the environment and the available analytical methodologies. Despite the good results of using pesticides in agriculture, their use in the environment is usually accompanied by deleterious environmental and public health effects. Pesticides hold a unique position among environmental contaminants due to their high biological activity and toxicity (acute or chronic). They are usually capable of harming all forms of life other than the targeted pest. The contamination by pesticides should be prevented as far as possible not only because of their direct toxicity to man, but also because of their influence on the water biocenosis and their potential accumulation in the food-chain. Moreover, due to the degradation of some herbicides, fungicides and insecticides used in the intensive agricultural fields that occurs in soils, surface and groundwater, the environment could be contaminated with different degradation products that are usually much more harmful than the parent molecules; however some of them could enter into the food chain through the water uptake by the plants. The microbial degradation of the permitted and widely used anilinogenic and phenoligenic pesticides such as 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, (2,4-D), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), phenylcarbamate, phenylurea, diuron, linuron and propanil results in chlorophenols and chloroanilines, two groups of highly toxic organochlorinated xenobiotics (Pandiyanet et al., 2002; Claver et al., 2006). They have high ecotoxicological effects and also are dangerous to humans as some of them have immunomodulating, endocrine-disrupting, mutagenic and carcinogenic effects. At the Faculty of Technology Novi Sad, the Project Partner in the LACREMED project, a rapid analytical method based on ultra-high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry coupled to heated electrospray ionization source (UHPLC-HESI- MS/MS) was developed for analysis of selected anilinogenic and phenoligenic compounds that have been targeted during the LACREMED: 3-chloroaniline (3-CA), 4-chloroaniline (4-CA), 3,4-dichloroaniline (34-DCA), 2,6-dimethylaniline (2,6-DMA), 3-chloro-4-methylaniline (3-C-4-MA), 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP), and 4-chloro-2-methylphenol (4-C-2MP). Samples used for the method development were:  Liquid media (aqueous solutions of glucose, L- asparagine, D, L-phenylalanine, adenine, thiamine and various salts) fortified with the selected xenobiotic diluted with initial mobile phase in order to get final solution with concentration within the calibration curve range.  Aqueous extract of soil samples fortified with the selected xenobiotic obtained after shaking of different types soils with ultra pure water and the centrifugation. All the samples were jointly prepared with the colleagues from the University of Szeged, a Lead Beneficiary in the LACREMED. All these facts have therefore attracted the attention of environmental chemists to investigate the chemodynamics and fate of pesticides in the environment. Analytical methodologies employed have to be capable of residue measurement at very low levels and must also provide unambiguous evidence to confirm both the identity and the concentration of any residues detected. In the literature a number of published papers dealing with the analysis of pesticides, some of their degradation and transformation products, by gas chromatography (GC) coupled to tandem mass spectrometry (MS/MS) and liquid chromatography (LC)-MS/MS. Nowadays, particularly LC has emerged as an excellent alternative technique, especially for the analyses of polar and thermo labile pesticides that are not readily amenable to GC or require derivatization before GC analysis; thus, it has been accepted as a routine technique for regulatory monitoring purposes in pesticide residue analysis.2

3 LACREMED 3 Smernice o analitickoj metodi razvijenoj u Široka upotreba pesticida u poljoprivredi i dodatno zagađenje životne sredine prouzrokovano emisijom tokom njihove industrijske proizvodnje dovelo je do široke rasprostranjenosti ovih hemikalija i njihovih metabolita u životnim namirnicama, vodi i zemljištu. Da bi se moglo pratiti njihovo prisustvo potrebno je razviti specifičnu, selektivnu i veoma osetljivu analitičku metodu, kojom je moguće obezbediti pouzdane podatke o prisustvu osnovnih jedinjenja i nastalih degradacionih proizvoda u različitim vrstama uzoraka. U samoj osnovi IPA CBC HUSRB projekta LACREMED, koji ima za cilj razvoj inovativnog pristupa u remedijaciji zemljišta i vode zagađenih pesticidima i njihovim metabolitima, nalazi se razvoj robustne analitičke metode za istovremeno određivanje anilinskih i fenolnih derivata pesticida, poznatih po toksičnosti i širokoj rasprostranjenosti. Uprkos dobrim rezultatima primene pesticida u poljoprivredi, njihovo korišćenje je često praćeno negativnim uticajem na životnu sredinu i zdravlje ljudi i životinja. U odnosu na druge zagađujuće materije u životnoj sredini, pesticidi imaju jedinstvenu poziciju zbog njihove visoke biološke aktivnosti i toksičnosti (akutne ili hronične). Pored uništavanja ciljanih štetočina, ova jedinjenja mogu da oštete i sve druge oblike života. Zagađenje pesticidima je potrebno sprečiti ne samo zbog njihove direktne toksičnosti po čoveka, već takođe i zbog njihovog negativnog uticaja na vodenu biocenozu i potencijalne akumulacije u lancu ishrane. Usled degradacije herbicida, fungicida i insekticida koji se koriste u intenzivnoj poljoprivredi i koji mogu biti prisutni u zemljištu, površinskoj i podzemnoj vodi, životna sredina može biti kontaminirana različitim degradacionim proizvodima koji su često štetniji od polaznih pesticida; takođe, neki od njih mogu se uneti u lanac ishrane putem uzimanja vode od strane biljaka. Mikrobiološka degradacija dozvoljenih i široko korištenih anilinskih i fenolnih pesticida kao što su 2,4-dihlorofenoksiacetatna kiselina, (2,4-D), 2,4,5-trihlorofenoksiacetatna kiselina (2,4,5-T), fenilkarbamat, fenilurea, diuron, linuron i propanil dovodi do pojave hlorfenola i hloranilina u životnoj sredini, dve grupe veoma toksičnih organohlornih ksenobiotika. Ova jedinjenja imaju izraženo ekotoksikološko dejstvo i takođe su opasni po zdravlje ljudi, pokazujući imunomodularne, mutagene, karcinogene efekte kao i štetno dejstvo na rad endokrinih žlezda. Na Tehnološkom fakultetu Novi Sad, projektnom partneru u projektu LACREMED, razvijen je brz analitički metod baziran na ultra-visoko pritisnoj hromatografiji saa zagrevajućim elektosprej jonizacijonim izvorom i tripl kvadrupolnim masenim detektorom (UHPLC-HESI- MS/MS) za analizu anilinskih i fenolnih jedinjenja odabranihu okviru projekta LACREMED: 3-hloroanilin (3-CA), 4-hloroanilin (4-CA), 3,4-dihloroanilin (34-DCA), 2,6-dimetilanilin (2,6-DMA), 3-hloro-4-metilanilin (3-C-4-MA), 2,4-dihlorofenol (2,4-DCP), i 4-hloro-2-metilfenol (4-C-2MP). Uzorci korišćeni za razvijanje i primenu metode bili sledeće prirode:  Tečni medijum (vodeni rastvor glukoze, L-asparagin, D,L – fenilalanin, adenin, tiamin i razne soli) u koji su dodati odabrani ksenobioticima, a koji je zatim razblažen sa polaznom UHPLC mobilnom fazom u cilju dobijanja rastvora sa koncentracijom u opsegu kalibracione krive;  Vodeni ekstrakt različitih tipova zemljišta u koje su dodati odabrani ksenobiotici; ekstrakti su dobijeni posle mućkanja zemljišta sa ultra čistom vodom i naknadnim centrifugiranja. Svi uzorci su pripremljeni zajednički sa kolegama sa Univerziteta u Segedinu, glavnim korisnikom u projektu LACREMED. Sve ove činjenice privlače pažnju istraživača u oblasti zaštite životne sredine namećući potrebu ispitivanja hemodinamike i sudbine pesticida u životnoj sredini. Analitičke metode koje se koriste u ovaj oblasti moraju omogućiti detekciju ksenobiotika u veoma niskim koncentracionim nivoima i nedvosmislenu potrvdu identiteta i koncentracija detektovanih jedinjenja. U literaturi su dostupni brojni radovi koji se bave analizom pesticida, njihovih degradacionih i transformacionih proizvoda gasnom (GC) i tečnom hromatografijom (LC) u kombinaciji sa masenom spektrometrijom (MS/MS). Ipak, LC je u današnje vreme često korišćena tehnika, posebno u analizi polarnih i termo labilnih pesticida, koji se ne mogu analizirati primenom GC bez prethodnog koraka derivatizacije; stoga, LC se smatra rutinskom tehnikom u analizi pesticida pri njihovom monitoringu u životnoj sredini.

4 A LACREMED projekt partnereként szereplő Újvidéki Egyetem Technológiai Tanszékén kifejlesztettek egy UHPLC- HESI-MS/MS-alapú (ultra-high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry coupled to heated electrospray ionization source) gyors analitikai módszert, amely alkalmas a LACREMED projektben vizsgált, anilin- és fenol-származékokat generáló peszticidek és származékaik kimutatására: 3-klóranilin (3-CA), 4-klóranilin (4-CA), 3,4-diklóranilin (34-DCA), 2,6-dimetilanilin (2,6-DMA), 3-klór-4-metilanilin (3-C-4-MA), 2,4-diklórfenol (2,4-DCP), és 4-klór-2-metilfenol (4-C-2MP). A módszerfejlesztésre felhasznált minták a következők voltak:  Folyékony tápoldatok (glükóz, L-aszparagin, D, L-fenilalanin, adenin, thiamin és különböző sók vizes oldatai) a kiválasztott xenobiotikummal adalékolva, melyek hígítása a kezdeti mobil fázissal történt annak érdekében, hogy a kalibrációs görbe tartományába eső koncentrációjú oldatok jöjjenek létre.  Különböző típusú, a kiválasztott xenobiotikummal kiegészített talajok ultratiszta vízzel történő rázásával és centrifugálással nyert vizes talajminta-extraktumok. Valamennyi minta előkészítése a LACREMED projekt Vezető Kedvezményezettjeként szereplő Szegedi Tudományegyetem munkatársaival közösen történt.4 A peszticidek mezőgazdaságban történő kiterjedt alkalmazása, továbbá a gyártásuk során ipari kibocsátás útján okozott további környezetszennyezés az élelmiszerárukban, vizekben és talajokban ezen vegyületek maradványainak és metabolitjainak a megjelenéséhez vezetett. Jelenlétük nyomon követésének érdekében specifikus, szelektív és szenzitív, több maradvány kimutatására alkalmas analitikai módszerekre van szükség, melyek megbízható adatokat nyújtanak az alapvegyületek és metabolitjaik jelenlétéről a különböző típusú mintákban. A peszticidekkel és metabolitjaikkal szennyezett talajok és vizek remediációjára szolgáló innovatív eljárás kifejlesztésére irányuló IPA CBC HU-SRB LACREMED projekt (HUSRB/1002/214/147) fő célja egy olyan megbízható analitikai módszer kidolgozása, mely lehetővé teszi a széles körben elterjedt és toxicitásukról ismert, fenolt és anilint generáló peszticidek származékainak egyidejű meghatározását. Ez az útmutató összefoglalja a LACREMED projekt keretein belül, az Újvidéki Egyetem Technológiai Karán rendelkezésre álló magas színvonalú műszerállomány segítségével kifejlesztett módszer jellemzőit, egyben rövid áttekintést nyújt a peszticidek környezetben történő előfordulásáról és a rendelkezésre álló analitikai módszerekről. Bár a peszticidek mezőgazdaságban történő felhasználása eredményes, a környezetben történő alkalmazásuk általában hátrányos környezeti és közegészségügyi hatásokkal jár. Jelentős biológiai aktivitásuk és akut vagy krónikus toxicitásuk miatt a peszticidek különleges helyzetet foglalnak el a környezetszennyező anyagok között. Általában képesek a megcélzott kártevő/kórokozó mellett más életformákat is károsítani. A peszticidek általi szennyeződést amennyire csak lehet, meg kell akadályozni, és nem csak az emberre gyakorolt közvetlen toxicitásuk miatt, hanem a vízi életközösségekre gyakorolt hatásuk és a táplálékláncban történő feldúsulásra való képességük miatt is. Ezen túl az intenzív művelésbe vont mezőgazdasági termőterületeken alkalmazott herbicidek, fungicidek és inszekticidek talajban, felszíni- és talajvizekben zajló lebomlása miatt a környezet különböző bomlástermékekkel szennyeződhet, melyek az alapvegyületeknél gyakran sokkal károsabbak; némelyikük a növények tápanyagfelvétele útján be is kerülhet a táplálékláncba. Az engedélyezett és széles körben alkalmazott, anilint és fenolt generáló peszticidek, mint a 2,4-diklórfenoxiecetsav (2,4-D), a 2,4,5- trikórfenoxiecetsav (2,4,5-T), a fenilkarbamát, a fenilurea, a diuron, a linuron és a propanil bomlása során klórfenolok és klóranilineket keletkeznek, melyek a klórozott szerves xenobiotikumok két erősen toxikus csoportját alkotják (Pandiyanet et al., 2002; Claver et al., 2006). Magas ökotoxikológiai hatásaik mellett az emberre is veszélyesek, mert némelyikük immunrendszert moduláló, endokrin rendszert romboló, mutagén és karcinogén hatású. Mindezen tények a környezeti kémikusokat a peszticidek kemodinamikájának és környezetbeli sorsának a vizsgálatára sarkallták. Az alkalmazott analitikai módszereknek képesnek kell lenni a származékok kis mennyiségeinek mérésére és egyértelmű bizonyítékot kell szolgáltatniuk bármilyen detektált vegyület azonosságának és koncentrációjának megerősítésére. A szakirodalomban számos publikáció foglalkozik a peszticidek, bizonyos bomlástermékeik és transzformált származékaik tandem tömegspektrometriával (MS/MS) kapcsolt gázkromatográfiával (GC) és (LC)-MS/MS folyadékkromatográfiával történő elemzésével. Napjainkban kiváló alternatív technikaként különösen az LC jelentősége növekszik, főként a poláris és hőlabilis peszticidek vizsgálatára, melyek nem, vagy csak származékképzés után alkalmasak GC elemzésre, ezért a peszticidszármazékok vizsgálata során rutin technikaként fogadták el nyomon követési célokra. LACREMED Kifejlesztett analitikai módszerek útmutatója

5 5 LACREMED Experimental conditions Eksperimentalni uslovi Kísérleti körülmények UHPLC UHPLC analysis was performed by AccelaTM (Thermo Fisher Scientific, USA). Each 10 µL samples was injected directly onto a Hypersil GOLD TM column, 50 x 2.1 mm i.d., 1.9 µm (Thermo Fisher Scientific, USA). A gradient UHPLC method used mobile phase A (water with 1% acetic acid and 5mM ammonium acetate) and B (methanol) at flow rate of 0.3 mL/min. The gradient is described in Figure 1. Figure 1 UHPLC-MS/MS conditions Analiza se zasniva na UHPLC sistemu - Accela TM (Thermo Fisher Scientific, USA). 10 µL svakog uzorka direktno je injektirano na Hypersil GOLD TM kolonu (Thermo Fisher Scientific, USA), dužine 50 mm, unutrašnjeg prečnika 2,1 mm, sa četicama 1,9 µm. Gradijent UHPLC metode sa mobilnom fazom A (voda sa 1% sirćetne kiseline i 5 mm amonijum acetata) i mobilnom fazom B (metanol) primenjen je sa protokom od 3 ml/min. UHPLC gradijent je prikazan na slici 1. UHPLC Slika 1. Optimizovani uslovi za UHPLC-MS/MS UHPLC Az UHPLC analízist Accela TM (Thermo Fisher Scientific, USA) rendszeren végeztük. Minden mintánál 10 µL-t injektáltunk közvetlenül egy Hypersil GOLD TM (Thermo Fisher Scientific, USA) oszlopra (50 x 2,1 mm i.d., 1,9 µm). Az elválasztás grádiens elúcióval történt, ahol a mozgó fázis A (víz 1% ecetsavval és 5 mM ammónium-acetáttal) és B (metanol) eluensének áramlási sebessége 0,3 mL/min volt. A grádienst az 1. ábra mutatja be. 1. ábra: UHPLC-MS/MS körülmények Mass spectrometry – MS/MS MS/MS analysis was carried out on the triple quadrupole mass spectrometer TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific, USA) with heated- electrospray ionization probe (HESI-II, Thermo Fisher Scientific, USA,). The MS conditions were as follows (Figure 1): Ion source polarity: positive/negative ion mode Spray voltage: 3.4 kV Vaporizer temperature:350°C Sheath gas pressure (N2): 35 arbitrary units Auxiliary gas pressure: 10 arbitrary units Capillary temperature: 240°C Masena spektrometrija – MS/MS Tömegspektrometria – MS/MS Optimizovani MS uslovi (Slika 1): Polarnost jonskog izvora: pozitivan/negativan jonski mod Napon spreja: 3,4 kV Temperatura isparivača (vaporizer): 350 o C Protok azota kao „sheath“ gasa (N2): 35 arbitarnih jedinica Protok azota kao „auxiliary“ gasa (N2): 10 arbitarnih jedinica Temperatura kapilare: 240 o C Az MS/MS analízist fűtött-elektrospray ionizációs próbával (HESI-II, Thermo Fisher Scientific, USA) kapcsolt TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific, USA) tripla-kvadrupól tömegspektrométerrel (MS) végeztük. Az MS paraméterek a következők voltak (1. ábra): Ionforrás polaritás: pozitív/negatív ionmód Spray-feszültség: 3,4 kV Porlasztó hőmérséklet: 350 °C Szárító gáz nyomása (N 2 ): 35 egyedi egység Segédgáz nyomása: 10 egyedi egység Kapilláris hőmérséklet: 240 °C (a) (b) Figure 2 Optimization of collision energies of 2,4 DCP (a) and 3 CA (b) Slika 2. Optimizacija kolizione energije za 2,4 DCP (a) i 3 CA (b) 2. ábra. Az ütközési energia optimalizálása a 2,4 DCP (a) és a 3 CA (b) esetében MS/MS analiza vršena je sa tripl kvadrupolnim detektorom TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific, USA) sa zagrevajućim elektrosprej jonizacijonim izvorom (HESI-II, Thermo Fisher Scientific, USA).

6 6 LACREMED Compounds Ksenobiotici Xenobiotikumok t R a, min. Ionization mod Jonizacioni mod Ionizációs mód Precursor ion (m/z) Prekursor jon (m/z) Prekurzor ion (m/z) Product ions b (m/z) Produkt joni b (m/z) Termék ionok b (m/z) CID c (eV) 3-CA /75.131/33 4-CA /75.131/33 3,4-DCA /74.121/49 2,6-DMA /79.129/21 3-C-4-MA / /17 2,4-DCP / /19 4-C-2MP / /19 a Retention time b Numerical values are\ given in the order quantifier/qualifier ion. c Collision-induced dissociation energy for quantifier/qualifier ion. Table 1. Optimized UHPLC-HESI-MS/MS parameters for selected xenobiotics Tabela 1. Optimizovani parametri UHPLC-HESI-MS/MS metode za ispitivane ksenobiotike a Retenciono vreme b Jon korišten za kvantifikaciju („quantifier“) /jon korišten za identifikaciju („qualifier“) jon. c Optimizovana koliziona energija za dobijeni „quantifier“/„qualifier“ jon pri cepanju prekursor jona. 1. táblázat: A szelektált xenobiotikumokra optimalizált UHPLC-HESI-MS/MS paraméterek a Retenciós idő b A számértékek a mennyiségi/minőségi meghatározásban résztvevő ionok szerint vannak megadva. c Az ütközés indukálta disszociációs energiák a mennyiségi/minőségi meghatározásban résztvevő ionok szerint 3C-4MA R 2 = W:1/X 3CA R 2 = W:1/X 2,4-DCP R 2 = W:1/X 3,4-DCA R 2 = W:1/X 4 CA R2= W:1/X 4C-2MP R2= W:1/X Figure 3 Calibration curves for some of xenobiotic Slika 3. Kalibracione krive za izabrane ksenobiotike 3. ábra: Néhány xenobiotikum kalibrációs görbéje References/Literatura/Irodalom  Botitsi, H., Economou, A., Tsipi, D Anal. Bioanal. Chem. 389,  Claver, A., Ormad, P., Rodriguez, L., Ovelleiro, J. L Chemosphere, 64, 1437–1443.  Frenich, G. A., Martínez Salvador, I., MartínezVidal, J. L., López-López, T Anal. Bioanal. Chem. 383, 1106–1118.  Hiemstra, M. and Kok, A. 2007J. Chromatogr. A. 1154,  Kampioti, A. A., Borba da Cunha, A. C., López de Alda, M., Barceló, D Anal. Bioanal. Chem. 382, 1815–1825.  Pandiyan, T., Rivas, O. M., Martinez, J. O., Amezcua, G.B., Martinez-Carrillo, M.A J. Photoch. Photobio. A. 146 (3), 149–155.  Sajben-Nagy, E., Manczinger, L., Škrbić, B., Živančev, J., Antić, I., Krisch, J., Vágvölgyi, Cs Proceedings of 15th Danube-Kris-Mures-Tisa (DKMT) Euroregion Conference on Environment and Health with satellite event LACREMED Conference “Sustainable agricultural production: restoration of agricultural soil quality by remediation“, p , Novi Sad, Serbia, May,  Sannino, A. and Bandini, M Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 2729–2733. This document has been produced with the financial assistance of the European Union. The content of the document is the sole responsibility of the Faculty of Technology, University of Novi Sad, Serbia and can under no circumstances be regarded as reflecting the position of the European Union and/or the Managing Authority. Ovaj dokument je odštampan uz finansijsku podršku Evropske unije. Za sadržaj ovog dokumenta je odgovoran isključivo Tehnološki fakultet Univerzitet u Novom Sadu i sadržaj ovog dokumenta ne odražava zvanično mišljenje Evropske unije i/ili Direktorata. Ez a dokumentum az Európai Unió pénzügyi támogatásával valósult meg. A dokumentum tartalmáért teljes mértékben a Technológia Kar, Újvidéki Egyetem, Szerbia vállalja a felelősséget, és az semmilyen körülmények között nem tekinthető az Európai Unió és/vagy az Irányító Hatóság állásfoglalását tükröző tartalomnak.


Letölteni ppt "The project is co-financed by the European Union www.hu-srb-ipa.com Projekat sufinansira Evropska Unija A projekt az Európai Unió társfinszírozásával valósul."

Hasonló előadás


Google Hirdetések