Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

SiRNAs: APPLICATIONS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND POTENTIAL AS THERAPEUTICS Yair Dorsett and Thomas Tuschl Nature 318 | APRIL 2004 | VOLUME 3 (www.nature.com/reviews/drugdisc)

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "SiRNAs: APPLICATIONS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND POTENTIAL AS THERAPEUTICS Yair Dorsett and Thomas Tuschl Nature 318 | APRIL 2004 | VOLUME 3 (www.nature.com/reviews/drugdisc)"— Előadás másolata:

1 siRNAs: APPLICATIONS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND POTENTIAL AS THERAPEUTICS Yair Dorsett and Thomas Tuschl Nature 318 | APRIL 2004 | VOLUME 3 (www.nature.com/reviews/drugdisc) Készítette: Lipinszki Zoltán IV. Biológus Bioinformatika szakirodalmi tanulmányok

2 I. Bevezetés 1.Klasszikus genetika: azonosítja a génmutációt, aminek hatásaként egy ismert funkció, vagy biokémiai útvonal megsérült: időigényes, sokszor nehezen hajtható végre (emlősök). 2.Reverz genetika: génmutációt indukál, hogy ismeretlen funkciót vagy biokémiai utat tárjon fel: időigényes és drága. 3.Nukleinsav alapú megközelítés: genomszekvenciák; szekvencia-specifikus módon képesek vagyunk gének expressziójának elcsendesítésére! Mutációk indukálása vagy keresése nélkül azonosítható a génhez tartozó funkció Andrew Fire és Craig Mello: felfedezik az RNS interferencia jelenségét Caenorhabditis elegans-ban (STORY: dsRNS  azonos szekv  mRNS degradáció)!!! PTGS  Post-transzkripcionális gén „elcsendesítés”

3 Hosszú dsRNS  növények, gombák, protozoák, sok magasabbrendű eukarióta! Működött!!  a legtöbb emlősben nem működött (INF reakció!!) Rövidebb dsRNS  siRNS már nem váltja ki az INF választ!

4 II. Nukleinsav-alapú géncsendesítés A három legfontosabb molekula: 1.ODN – Oligo-Deoxi-riboNukleinsav. - ~20 nt - célpont: pre-mRNS és mRNS a. RNS-DNS duplexet képez  RNáz H  degradáció - Kémiailag módosítva  Rnáz H nem köti meg: b. Sztérikus gátat képez: transzláció és splicing inhibítor c. dsDNS-sel tripla hélixet képez: transzkripció inhibítor

5 2. Ribozimok (ribozyames): - RNS alapú enzimek; szintetikusan és in vivo is előállíthatóak!!! - párosodnak a target RNS-sel (Watson Crick) - katalizálják a foszfátgerinc felszakadását (hidrolízis) - számos csoportjuk ismert: pl. ‘Kalapácsfejű’ ribozimok: kétértékű fémek jelenlétében (Mg++) a fejet (dsRNS) szegélyező cél-komplementer ssRNS szakaszok párosodnak a felismerési szekvenciával a lebontandó-RNS-en.

6 3. siRNS-ek : -megtalálhatók a természetben: hosszú dsRNS-ből hasogatja le a DICER enzim (Rnáz-III) nt hosszúak: 2 nukleotidos 3’- és 5’-túlnyúló véggel -siRNS + proteinek  RISC (RNS indukálta elcsendesítő komplexum) -Az RISC felismeri azokat az mRNS-et, amelyek komplementerek az siRNS 5’-végének 10 nukleotidjával  HASÍTÁS! -Szintetikusan és in vivo (vektorok) is előállítható.

7 miRNS- mikroRNS: -a sejt használja génexpresszió szabályozásra -70 nt hajtű prekurzorból vágódik ki: nt -miRNS + proteinek  miRNP  riboszóma\transzláció gátló

8 III. A géncsendesítő módszerek összehasonlítása -Előnyök-hátrányok- Számos kutatócsoport dolgozott rajta  a hatékonyság sokmindentől függ: 1.Koncentráció (reagens) 2.Transzfekciós technika 3.Sejt típus 4.Célhely kiválasztása 5.Kémiai módosítás 6.Adat analízisek ideje  értelmezése

9 ODN vs. siRNS: -Az eddigi kísérletek (kivéve kettőt) azt bizonyították, hogy az siRNS-ek hatékonyabban képesek elcsendesíteni a génexpressziót, valamint hosszabb-tartamú a hatásuk, mint az ODN-nek! Ribozim vs. siRNS: -Szisztematikus és kiterjedt vizsgálatokkal megállapították, hogy a gének hatásának elcsendesítésében az siRNS-ek hatékonyabbak, mint a ribozimok. -A ribozimok közül pedig nem a ‘kalapácsfejű’, hanem inkább az ún. ‘hosszú hajtű hurkos’ formák az effektívebbek! ODN : -Az egyes módosított formákról (pl. foszforotiosavval ) kimutatták, hogy toxikusak lehetnek, mert nem specifikusan endogén fehérjékhez kötődnek! -CpG motívumuk TLR-hoz képes kötődni  beindul az INF válasz más öröklött immunitási mechanizmusokkal együtt!!!  Nem specifikus hatás

10 Rossz  nem specifikus, toxikus Jó  Terápiás alkalmazás rákos megbetegedések és vírusfertőzés esetén! Ribozimok: -Az ODN-hoz hasonlóan, főleg a módosított formák protein segédlet nélkül képesek megkötni a cél-RNS-t:  nagy koncentrációban kell alkalmazni  gyakoribbá válik a nem specifikus felismerés!  Kiküszöbölhető: RNS lokalizációs szignál vagy RNS dajkafehérjék együttes alkalmazásával  kisebb koncentráció!! siRNS : stabilabbak  védettek a ss endonukleázokkal szemben! !!! Fontos az első néhány bp termodinamikai stabilitása !!!  Ennek függvényében dől el, hogy melyik siRNS épül be a RISC-be !!! -RISC komplexben hatékonyabb és kevesebb a nem specifikus felismerés is! -Kis koncentrációban is hatásos! ANTISENSE

11 Off-target hatás… -A nem specifikus hatás mellett erre is hajlamosak a fenti alkalmazások. -Vagyis megkötik azokat az RNS-et is, amelyek közel hasonló szekvenciával rendelkeznek, mint a cél-RNS. ODN  szereti (Rnáz H-nak csak 6-7 bp kell a hasításhoz) siRNS  ha nincs gondosan kiválogatva ( TERMODINAMIKA ), akkor az endogén miRNS felismerési helyére bekötve leállítja a transzlációt (nem csak egy fehérje esetében) RISC STOP

12 IV. Vektorok: siRNS termelés -Ribozimok vektorokkal bejuttathatók a sejtbe és indukálható a termelődésük. -Kiderült, hogy a szintetikus előállítás mellett az siRNS-ek is bejuttathatók vektorokkal! -A vektor:  beintegrálódhat a genomba : hosszú távú hatás („kiüti” az endogén transzkriptumot) -adenovírus, adenoasszociált vírus (AAV), retrovírus, lentivírus. polII. vagy polII. promótert használva RNS hajtűt szintetizálnak a transzdukció után  extrakromoszómális elemként  hajtű - lehetőség van fejlődés- és\vagy szövet specifikus bejuttatásra

13 V. siRNS bejuttatása és in vivo felszabadulása 1.Intravénásan (ODN, klinikai gyógyszerkutatási kísérletek) 2.Plazmidokkal (siRNS, Ribozim) 3.Vírusokkal (siRNS) Emlős modellekbe -elektroporációval -helyi és szisztémás injektálással

14 PÉLDÁK 1.siRNS injekció: -a nagynyomású farokvénába siRNS-t injektáltak -90%-ban lecsökkent a cél-gén „expressziója” -hely: máj, lép, tüdő, vese, hasnyálmirigy

15 2. siRNS készítő vírusok: -domináns humán betegségek lehetséges gyógyszerei -génfunkciók vizsgálata emlős szervezetekben -a rekombináns AAV lehetőséget biztosít arra, hogy hosszú távon kifejezhessünk siRNS-t az osztódó és a nem osztódó sejtekben egyaránt! -Egér agyba vagy a májba injektálva a fenti AAV vírust, 7 héttel később nagyfokú célzott génelhallgatás volt detektálható az infekciós terület körül!

16 -terápia  Ribozimiok: HIV elleni terápiás kezelés  I és II. klinikai fázisban van!!!!!!!!! siRNS: szövetben a HIV-et sikeresen megcélozza!!!  HA TERÁPIÁS SZERKÉNT AKARJUK HASZNÁLNI, AKKOR KI KELL ALAKÍTANI EGY OLYAN ELJÁRÁST, AMELY SZABÁLYOZZA AZ siRNS ENYHE FELSZABADULÁSÁT in vivo! 3. Speciális kis molekulák: -elősegítik a makromolekuláink (pl ODN) transzdermális penetrációját! 4. Aeroszolok: -tüdőbe juttatás

17 VI. siRNS: in vivo gén funkció felkutatás - Lehetőséget kínál az egér és a patkány génállományának analízisére! - ”Kiütött egerek” készíthetők  előnyösebbnek ígérkezik, mint a homológ rekombináció (idő, pénz, nehézség). - Funkcionálisan redundáns, több kópiás gének esetében ELMÉLETILEG elegendő egyetlen transzgén konstruálása  a kon- zervált domén megcélzása (siRNS) mindegyik gén transzkrip- tumának eliminálásához vezet! - Szabályozható emlősökben is a különféle gének időbeli és szövetspecifikus expressziójának mértéke!!

18

19 VII. siRNS: teljes genomi vizsgálatok PÉLDÁKKAL BMUTATVA: 1. C. elegans és D. melanogaster: long dsRNA -”háztartási”és „fiziológiai” gének azonosítása (sejtciklus, apoptózis, sejt morfológia metabolikus gének). 2. Emlősök: - eddig csak nem-emlős gerincesekben lehetett genetikai vizsgálatot végezni (zebrahal) - ELŐSÖKBEN csak kevés genetikai vizsgálatot lehetett végezni (egér) -RNSi  új lehetőségek nyíltak meg! -emlős sejtkultúra -Xenopus oocita -egér, patkány -csirke embrió -humán sejttenyészet „Reverz genetika”-i vizsgálatok

20 -emlős sejtkultúra  legkedveltebb módszer: *magas hatásfok, kis koncentráció *nagy specificitás *jó stabilitás *közepes ár!!!!! ! apoptózis, szignalizáció, protein stabilitás szabályozása, UV hatás kijavítása ! Így azonosították az egyes komponenseit:

21 -RNSi alapú vizsgálat emlős sejtekben: *könnyen alkalmazható az egyszerűen transzfektálható osztódó, adherens sejtek esetében! *nem adherens sejtekben viszont elektroporációt kell alkalmazni! *kémiai módosítás is segítheti az siRNS felvételt elsődleges és\vagy nem adherens sejtek esetében (kis molekulák) 3. Potenciális gyógyszer célpontok keresése: - cDNS microarray  Rengeteg adat (több ezer gén) Melyik a jó? siRNS  egy adott génnek a túlműködése kimutatható Gyógyszerek felkutatása!!!!

22 Hátrányok 4. Hátrányok: - Nem alkalmas nem kódoló régiókban történt mutációk azonosítására! - Nem alkalmas funkciónyeréses mutációk és domináns negatívok előállítására- sokszor kell a funkció teljes megértéséhez! - Soha nem tünteti el teljes mértékben a cél-mRNS-t! - Számos más siRNS vizsgálatára van szükség a megfelelő megtalálásához! - A RISC mennyisége sejttípusonként eltérő lehet  limitálhatja az RNSi hatékonyságát Hosszútávon, amikor minden génnek meg lesz az siRNS-e, lehetőség lesz a fenti problémák kiküszöbölésére!

23 VIII: siRNS alapú terápiás alkalmazások -Már alkalmaznak: Ribozimokat ODN  citomegalovírus fertőzésre (fomivirsen) - kémiailag módosított: TOXIKUS, KIS HATÉKONYSÁG -második generációs antiszensz konstrukciók  ÍGÉRETES siRNS  fiatalok, MÉG nincs klinikai alkalmazás  Számos eredmény egerekben: szepszis, vírus, hepatitis, oculáris neurovascularizáció elleni védelem!Injekció  máj, lép.  Kimutatták, hogy a Hepatitis-B virust közvetlenül képes megcélozni. ?Milyen módosítások növelnék a specificitást és a hatékonyságot?

24 Köszönöm a figyelmet!!


Letölteni ppt "SiRNAs: APPLICATIONS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND POTENTIAL AS THERAPEUTICS Yair Dorsett and Thomas Tuschl Nature 318 | APRIL 2004 | VOLUME 3 (www.nature.com/reviews/drugdisc)"

Hasonló előadás


Google Hirdetések