Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

MA: Foszforilációs hely-specifikus ellenanyagok Nem-receptor protein tirozin kinázok: vírusok transzformáló génjeiként azonosították Fehérjék tirozin.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "MA: Foszforilációs hely-specifikus ellenanyagok Nem-receptor protein tirozin kinázok: vírusok transzformáló génjeiként azonosították Fehérjék tirozin."— Előadás másolata:

1

2

3 MA: Foszforilációs hely-specifikus ellenanyagok Nem-receptor protein tirozin kinázok: vírusok transzformáló génjeiként azonosították Fehérjék tirozin foszorilációja és a malignus transzformáció összefüggése

4 Tumor terápiában alkalmazható gyógyszerek

5 Nem receptor típusú protein tirozin kináz családok Src, lyn, fyn, blk, yes, hck, lck Zap70, syk Zap70, syk Receptorok az immunrenszerben Receptorok az immunrenszerben pl.: BCR, TCR, citokin R, IgE, IgG receptorok

6 Az acilezett fehérjék (pl. mirisztil csoporton keresztül a membránhoz kapcsolódó src – kinázok) és a GPI - kapcsolt fehérjék a koleszterinben gazdag lipid raftokban helyezkednek el Hogyan kapcsolódnak a nem-receptor kinázok a receptorhoz?Hogyan kapcsolódnak a nem-receptor kinázok a receptorhoz? Hogy aktiválódnak?Hogy aktiválódnak?

7 Glycosylphosphatidylinisotol (GPI)

8 Kináz célpontok: ITAM: Immunreceptor Tyrosine based Activation Motif

9

10 A receptor aktiváció citoszolban levő fehérjéket toborozhat a receptor közelébe.

11 YxxL/IYx2L/I D/E-x2- YxxL/I-x6-9Yx2L/I ITAM: Immunoreceptor Tirozin alapú Aktivációs Motívum Az aktiváció előfeltétele a receptor oligomerizáció!

12 A TCR által indukált jelpálya kezdeti tirozin foszforilációs lépései fyn

13 Figure 6-16

14 BCR

15 Figure 6-15 part 1 of 2

16 STAT aktiváció az interferon receptor jelátvitel során IRF: interferon regulatory factor ISGF: interferon- stimulated gene complex 3 ISRE: interferon stimulated response element

17 mastoparan Az FcRI jelátvitel kezdeti lépései

18 Az FcR által aktivált kinázok

19 Mire jó a foszforiláció? P P P P Megváltoztatja a konformációt Intramolekuláris kölcsönhatások Intermoleculáris kölcsönhatások * Enzim/Faktor aktivitás * Lokalizáció * Stabilitás VÁLTOZIK:

20 Protein foszfatázok P Kinázok Foszfatázok * A foszforiláció reverzibilis * Enzimek aktívan katalizálják * Különböző enzimcsaládok ellentétes reakciókat katalizálnak ATPADP PO 4 2- FONTOS: Protein defoszforiláció független, fiziológiailag releváns folyamat Protein defoszforiláció ki és bekapcsolhat mechanizmusokat

21 Kinázok Foszfatázok P Protein defoszforiláció OPO 3 2- OPO 3 2- OPO 3 2- CH H CH H CH CH 3 pTyrosinepSerinepThreonine

22 A foszfatázok fajtái: Tirozin specifikus (PTP) Receptor-típusú alcsalád Nem receptor-típusú alcsalád Kettős specifitású foszfatázok (Tyr és Ser/Thr) (PTEN) Kis molekulatömegű foszfatázok (LMW) Szerin/Treonin-specifikus foszfatázok PPP alcsalád PPM alcsalád Egyéb foszfatázok (eg. Hisztidine) Nem-specifikus foszfatázok (alkaline, savas foszfatázok) CX 5 R

23 Protein tirozin foszfatáz családok Tirozin-specifikus kettős specifitású PTEN LMW HCSAGXGRXG HCXXGXXR CXXXXXR CXXXXXR

24 Protein tirozin foszfatázok Rövid története : * 1970-es évek vége - tirozin kinázok felfedezése * 1980-as évek: megfigyelték a tirozin defoszforilációt. fiziológiai folyamat farmakológiai sajátságok – vanadát gátol. * Nyitott kérdések: Hogy néznek ki a foszfatázok? (klónozás) Hány PTPáz van? Specifikus/nem-specifikus? Reguláció? Hatásmechanizmus? Fiziológia jelentőség?

25 PTP specificitás és diverzitás: két extrém model PTKsPTPs PTKsPTPs sok PTP nagy szubsztrát specificitás kevés PTP alacsony specificitás

26 Konklúzió : * PTP család, számos taggal, 1 v. 2 foszfatáz doménnel 2001-ben: 2001-ben: * PTP szupercsalád 38 humán PTP gén 17 különböző szerkezetű család (8 receptor-szerű, 9 nem receptor-szerű). több tucat homológ fehérje

27 (From: Andersen et al., MCB 21, , 2001) HCSAGXGRXG

28 A foszfatáz katalitikus domén vázlatosan: 9Å Asp Cys * Bemélyedő zsebben van a kötőhely * A kritikus aminosavak ennek az aljában vannak Mélysége (9Å) túl mély a pSer, pThr maradékoknak -> specificitás További specificitást a hidrofób oldalláncok biztosítanak, amelyek stabilizálják a tirozin fenolgyűrűjét

29 PTP-Cys - S P -O O O Asp181 O OH A. Kovalens cisztein-foszfát kötés, a tirozin felszabadul. PTP-Cys - S P -O O H H O Asp181 O O- (From Barford et al., Nature Structural Biology 2, , 1995) B. A cisztein-foszfor kötés hidrolízise, az enzim regenerálódása. Két lépésban defoszforilál!

30 PTP-hez kapcsolódó szabályozás:  SRC családba tartozó kinázok aktiválása: tirozin defoszforiláció útján  PTP aktivitás szabályozása:  receptor típusú PTP-k dimerizálódása (CD45, RPTPa).  SH2 domén kötődés  H2O2-tól függő szabályozás

31 CD45 PTP1B T-sejt PTP CD45 LAR PTP1B hasonló a CD45-höz 74% 37% 33% 44% 34%

32 Ligandum közvetített dimerizáció Probléma: kevés ligandum ismert. a ligandum kötődés következményei nem ismertek. Hogyan tanulmányozható a dimerizálódás ligandum nélkül?? Megoldás: EGFR-CD45 kiméra molekula EGFR CD45 membrán

33 Conclusion: Ligand binding and dimerization is inhibitory! CD45-deficiens Jurkat T-sejtek (plusz stimuláció TCR-en keresztül) (nem transzfektált sejtek) Nincs TCR signaling CD45 expresszió TCR signaling A CD45 elengedhetetlen a T sejtek aktivációjához (Jurkat sejt ) EGFR-CD45 expresszió TCR signaling EGFR-CD45 expresszió plusz EGF Nincs TCR signaling From: Desai et al., Cell 73, , 1993 A ligandum kötődése és a dimerizáció gátló hatású!

34 Hogyan? 1996: röntgenszerkezet : RPTP , D1 domén: 1. Dimerizálódás 2. A “wedge” domén az N-terminuson, gátolja a katalitikus doménhez való hozzáférést “wedge” domain Catalytic cleft Based on: Bilwes et al., Nature 382, , 1996 A ligandum kötődése és a dimerizáció gátló hatású!

35 Wedge domén gátolja a PTP activitását a dimerben. A mutációt hordozó wedge domén : megakadályozza az inaktivációt (foszfatáz aktivitás nő): E613R CD45 hiper-aktív “knock-in” egerekben in vivo; Egerekben limfocita proliferáció, ellenanyag termelés  halál (Majeti et al., Cell 103, , 2000)

36 Active Inactive Ligand P P Active Inactive After: Weiss and Schlessinger,Cell 94, , 1998 PTK és PTP ligandum által indukált aktiválódásának összehasonlítása RPTK RPTP

37 A foszforiláció szabályozásának módjai: –SH2 domén által közvetített –H2O2 által közvetített

38 SH3SH2Kinase Y Y p Src activity: Src phosphorylation, part I Foszforiláció szabályozás pY SH2 doménhez való kötődése által autofoszforiláció

39 SH3SH2Kinase Y 416 Y 527 Src activity: p CSK Src phosphorylation, part II C terminális src kináz

40 SRC aktiválódása Tyr defoszforiláció útján SH3 P P SH2 PTK pY527 Inactive conformation (“closed”) SH3 PTK Y527 P pY416 Active conformation (“open”) SH2

41 ROS felszabadulás biológiai jelekre reactive oxygen species H 2 O 2 -től függő szabályozás Biológiai stimulusok, amelyek indukálják a ROS keletkezését: Légzési elektrontranszport lánc

42 PTPs: Cys-SH pKa= Cys-S-OH H2O2H2O2 (Sulfenic acid) Cys-S - DTT Thioredoxin Magasabb oxidációs állapot, inaktív, irreverzibilis (vanadate ions) pTyr defoszforiláció H 2 O 2 által történő PTP szabályozás Acid dissociation constant, Ka, (also known as acidity constant, or acid-ionization constant) is a quantitative measure of the strength of an acid in solution

43 Konklúzió : H 2 O 2 képes enzimeket megtámadni, ha azok rendelkeznek H 2 O 2 képes enzimeket megtámadni, ha azok rendelkeznek kritikus helyzetben levő ciszteinnel H 2 O 2 különösen befolyásolhat olyan fehérjéket, amelyekben a H 2 O 2 különösen befolyásolhat olyan fehérjéket, amelyekben a Cys alacsony pKa –val rendelkezik, mint amilyenek a foszfatázok H 2 O 2 relatív gyenge oxidáns, amelynek aktivitását a sejtben H 2 O 2 relatív gyenge oxidáns, amelynek aktivitását a sejtben meglévő mechanizmusok szabályozzák. Reverzibilis hatású. H 2 O 2 keletkezhet fiziológiás jelátviteli folyamatok során a H 2 O 2 keletkezhet fiziológiás jelátviteli folyamatok során asejtekben * H 2 O 2 mint másodlagos hírvivő fejtheti ki hatását.

44 (From: Andersen et al., MCB 21, , 2001)

45 SH2 doméneket tartalmazó PTP-k: SH2 doméneket tartalmazó PTP-k: SH2 PTP 64%53%57% SHP1 SHP2

46 SH3 P P SH2 PTK pY527 Inactive conformation (“closed”) Intramolekuláris kötés Src N-SH2 C-SH2 PTP pTyr binding site Inactive conformation (“closed”) N-SH2 C-SH2 PTP P Active conformation (“open”) SHP2 SH3 PTK Y527 P pY416 Active conformation (“open”) SH2 After: Weiss and Schlessinger,Cell 94, , 1998

47 Az SHP-2 által történő pozitív jelpálya szabályozás modelljei

48 A foszfatázok fajtái: Tirozin specifikus (PTP) Receptor-típusú alcsalád Nem receptor-típusú alcsalád Kettős specifitású foszfatázok (Tyr és Ser/Thr) (PTEN, Myotubularin) Kis molekulatömegű foszfatázok (LMW) Szerin/Treonin-specifikus foszfatázok PPP alcsalád PPM alcsalád Egyéb foszfatázok (eg. Hisztidine) Nem-specifikus foszfatázok (alkaline, savas foszfatázok) CX 5 R

49 * Tirozin ÉS Szerin/Treonin defoszforiláció. * Molekuláris mechanizmus a tirozin foszfatázokéhoz hasonló (cystein, etc.) * Sekélyebb katalitikus zseb Kettős specifitású foszfatázok * in vitro nagy szubsztrát specificitás

50 MKP- MAP Kináz foszfatázok Stimulus MAP kinase kinase kinase MAP kinase kinase MAP kinase Substrates

51 TXYTXY TXYTXY P P TXYTXY P Ser/Thr PPs (PP2A) TXYTXY P Tyr PTPs (HePTP STEP PTP-SL) TXYTXY Dual-specificity PPs MAPKK After: Camps et al., Faseb J. 14, 6-16, 1999 MAPK

52 A foszfatázok fajtái: Tirozin specifikus (PTP) Receptor-típusú alcsalád Nem receptor-típusú alcsalád Kettős specifitású foszfatázok (Tyr és Ser/Thr) (PTEN, Myotubularin) Kis molekulatömegű foszfatázok (LMW) Szerin/Treonin-specifikus foszfatázok PPP alcsalád PPM alcsalád Egyéb foszfatázok (eg. Hisztidine) Nem-specifikus foszfatázok (alkaline, savas foszfatázok) CX 5 R

53 Kis molekula tömegű (LMW) tirozin foszfatázok “standard” PTP Low MW PTP ~240 residues (minimal MW=~26-30 kDa) ~160 residues (MW=~18 kDa) CXXXXXR motif (after: Ramponi & Stefani, BBA 1341, , 1997) Overall, sharp differences in 3-dimensional structure

54 Major types of protein phosphatases Tyrosine-specific (PTP) Receptor-type subfamily Non receptor-type subfamily Dual Specificity (Tyr and Ser/Thr) Low Molecular Weight (LMW) Serine/Threonine-specific PPP subfamily PPM subfamily Other phosphatases (eg. Histindine) Non-specific phosphatases (alkaline, acid phosphatases) Serine/Threonine-specific PPP subfamily PPM subfamily CX 5 R

55 Szerin-treonin foszfatázok Sematikus szerkezet: A B C scaffold regulátor katalitikus

56 A B C Alapvető különbségek a ser/Thr és Tyr foszfatázok között : Ser/Thr Tyr Szerkezet: Holoenzimek egy láncú enzimek Variabilitás:kevés katalitikus alegység sok féle enzim Specificitás:mindhárom alegység szabja egyetlen enzim meg Katalitikus mechanizmus: Teljesen eltérőFarmakológia: Teljesen eltérő

57 Ser/Thr Phosphatases PPM subfamily PPP subfamily PP1 PP2A PP2B PP2C PPP1 PPP2A PPP5 So many functions, so few enzymes? (Protein phosphatase 2 (PP2)) Raf MEK Akt PPM family, which includes PP2C and pyruvate dehydrogenase phosphatase, are enzymes with Mn2+/Mg2+ metal ions that are resistant to classic inhibitors Célpont:

58 B Catalytic: C  or C  PR55 (  ) PR61 (  ) PR72, PR130 PR59, PR48 PR93/SG2NA PR110/striatin PP2A = több tucat molekuláris kapcsolat! C B’ B’’ B’’’ Scaffold: PR65  or  A Regulátor alegységek Konstitutív kötődés

59 Ser/Thr foszfatázok PPM subfamily PPP subfamily PP1 PP2A PP2B PP2C Gátlószer: (okadaic acid microcystin) Gátlószer (FK506 cyclosporin) Ca ++ függő Aktív hely: Mn ++, Fe ++ Mn++,/ 2X Mg ++ Hasonló: alapszerkezet, általános alak, alapvető katalitikus mechanizmus Eltérő: szekvencia, katalitikus mechanizmus részletei, biokémiája. calcineurin

60 Példa a PP2A-függő szabályozásra fiziológiás folyamat során: Insulin receptor IRS 1/2 PI3-K p85 p110 PtdIns(3,4)P 2 or PtdIns(3,4,5)P 3 PH kinase Inactive PKB ATPADP PDK1 Inactive PKB kinase PH Active PKB Pi PP2A (PKB=AKT, =Ser/Thr kinase) Active PKB (Downstream signaling events) (from: Millward et al., TIBS 24, , 1999)

61 Péda a PP2A-függő szabályozó hatására (2) TXYTXY TXYTXY P P TXYTXY P Ser/Thr PPs TXYTXY P Tyr PTPs (HePTP STEP PTP-SL) TXYTXY Dual-specificity PPs MAPKK MAPK PP2A MAPK cascade Negatív visszacsatolás

62


Letölteni ppt "MA: Foszforilációs hely-specifikus ellenanyagok Nem-receptor protein tirozin kinázok: vírusok transzformáló génjeiként azonosították Fehérjék tirozin."

Hasonló előadás


Google Hirdetések