Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

A baktérium genom integritását védelmező rendszerek restrikció modifikáció DNS sérülés DNS javítórendszerek.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "A baktérium genom integritását védelmező rendszerek restrikció modifikáció DNS sérülés DNS javítórendszerek."— Előadás másolata:

1 A baktérium genom integritását védelmező rendszerek restrikció modifikáció DNS sérülés DNS javítórendszerek

2 Az örökítés lényege, az örökítő anyag állandósága Általában az idegen eredetű örökítő anyag káros Eukarióta szervezetekben a meiózis, mitózis során a kromoszóma párosodás során csak a megfelelő kromoszómák kerülhetnek egymás mellé Prokarióta szervezetknél ez a mechanizmus nem létezik, mégis van olyan rendszerük, mellyel saját DNS- üket meg tudják jelölni

3 Ilyen módon megkülönböztethető a saját és idegen DNS –A saját DNS jelölésére metiláz rendszer 6-metil adenin (metilezett nukleotidok) 5 metil citozin –Metiláz gének hsd, gazdaspecifikus metiláció dam, adenin metilálás –Újonnan keletkezett szál metilezése –Replikáció kontroll –Repair rendszerhez jelölt DNS dcm, citozin metiláz –A baktériumban a DNS módosítása biztosít –Amelyik DNS nem metilezett azt a gazda restrikciós rendszere elhasítja

4 A restrikció/modifikáció teremtette meg a „génsebészet, génmérnökség, genetic engineering” alapját Fág/baktérium rendszerben fedezték fel –Egy törzsből kikerülő fág képes ugyanazon baktériumtörzs fertőzésére –Az a fág, mely más törzsről származik restrikciónak van kitéve –A fág DNS a gazda szervezet mintázata szerint módosul (metilálódik) –Célja, hogy ellensúlyozza a bakteriális szekvenciák mozgását (plazmidok, fágok)

5

6 Más védekezés fágok ellen

7 RM rendszer mint addikiós modul: Toxin/Antitoxin

8 Stimulálja a rekombinációt

9 A restrikció/modifikáció lényege tehát –A baktérium törzs DNS-e metilálódik (a saját DNS jelölődik, vagy a baktériumban lévő fág DNS-e, ha fágfertőzés van) –A nem metilált DNS-t a restrikciós enzimek hasítják (baktériumsejtben lévő idegen /fág/ DNS elbomlik) –A metilezett DNS-t nem hasítja a restrikciós enzim (a sajátként jelölt DNS védett, illetve az ugyanazon a törzsből származó fág DNS is védett)

10 Restrikciós modifikációs rendszerek –I típus –II típus, leggyakoribb –III típus –IV típus

11 I típusII típusIII típus(IV típus) Fehérje szerkezet Bifunkcionális enzim 3 alegységgel Endonukleáz és metiláz 2 külön enzim Bifunkcionális enzim 2 alegységgel Felismerési szekvencia Bipartit és asszimmetrikus (TGAN 8 TGCT) 4-6 bp (gyakran) palindrom szekvencia 5-7 bp asszimmetrikus szekvencia Metilált szekvencia Hasító hely Nem specifikus, a felismerő helytől 1000 bp- ra Ugyanaz, mint a felismerő hely bp, a felismerőhelytől visszafele Restrikció/ metiláció Egymást kizáró aktivitás Külön reakcióSzimultán reakció Hasítás, ha metilált szekvencia ATP igény vannincs

12 Restrikciós/modifikáló rendszer működése DNS replikáció DNS állapota metilázrestrikcióeredmény Eredeti DNSmetilált--- Éppen replikálódó DNS hemi metilált+-metiláció Replikálódott DNS metilált--- Idegen DNSnem metilált/ másképpen + ?+degradáció

13 II típusú restrikciós/modifikáló rendszer –A teljesen metilált hely nem metilálódik és nem hasítja a restrikciós enzim –A hemimetilált helyet nem ismeri fel a restrikciós enzim, de a metiláz teljesen metilálhatja –A nem metilált hely szubsztrátja lehet a restrikciós enzimnek (in vitro a modifikáló enzimnek, in vivo hasítás) –A legelterjedtebb rendszer (baktériumok 1/3-ban) –Gén manipulációban nagyon fontos (sok különböző felismerési helyet ismerünk) 3’ és 5’ túlnyúló végek Kompatibilis és nem kompatibilis Tompa vég

14 Minden egyes enzim egy funkcióval rendelkezik A szerkezetük egyszerű (az EcoRI rendszer a legismertebb) A restrikciós enzim két azonos alegység dimerje A metiláz monomer –A restrikciós enzimmel közös célszekvencia felismerése (duplikáció vagy konvergens evolúció eredményezhette) Restrikciós hasítás –Több baktériumban is találtak ugyanolyan felismerőhelyű enzimet, ez az izoschizomer –A nem metilált célszekvenciánál (néha mellette) hasít az enzim Metiláció –Egy metilcsoportot ad hozzá majd disszociál –A következő metil csoportnál ugyanez ismétlődik

15 I és III típusú enzimek I típus –Multimerekből áll –Mindkét reakciót (restrikció/metiláció) elvégzik Kevésbé gyakori, mint a II típusú rendszer –3 különböző méretű alegységből áll (EcoK, EcoB) R restrikció M metiláció S szekvencia felismerés –R és M egyszerre nem működhet

16 –A működéshez, ATP, Mg ++, S-adenozil- metionin (SAM) szükséges Az enzim hozzáköt a felismerőhelyhez Ha az metilált nem történik semmi Ha hemimetilált (frissen replikálódott) metiláz aktivitás stimulálódik Nem metilált szekvenciánál az enzim kötve marad –Az enzim egyik vége ATP felhasználásával hurkot alkot –Amikor a hurok 1 kb nagyságú az egyik szálat elhasítja, egy másik enzim molekula a másik szálat hasítja

17 III típusú rendszer –Kevés rendszer ismert (P1 fágé, EcoP1) –A metiláz fehérje egyedül vagy komplexben működik –A restrikciós fehérje csak komplexben működhet –A felismerőhelytől (visszafele) bp-ra hasít IV típus (nem igazi besorolás) –A legtöbb rendszerben a restrikciós enzim nem ott hasít, ahol metilált a DNS (azaz a metiláció védettséget ad) –A IV típusnál éppen a metilált DNS hasítódik –HpaII és MspI izoschizomerek, ugyanazt a szekvenciát ismerik fel HpaII akkor hasít, ha a DNS nem metilált MspI akkor hasít, ha a szekvencia metilált

18 R/M a bakteriofágokban –Gyakran védekeznek a gazda restrikció ellen Saját metilációs enzimmel rendelkeznek Olyan fehérje is létezik, amely gátolj a gazda restrikciós enzimjét Elnevezésük –EcoRI –Genus, faj rövidítéssel, restrikció, ha több is van akkor római számokkal

19 DNS sérülés Mikroorganizmusok káros környezeti hatásra elvesztik életképességüket Ezt a veszteséget grafikonon ábrázolva dózisgörbét kapunk y=túlélő frakció, x=dózis A túlélési görbe vizsgálatával a sugárzási hatások magyarázhatók voltak, itt mutatkozott először, hogy a környezeti hatásra sérült DNS kijavítódik

20 Ezt a fajta viselkedést egy matematikai módszer a célelmélet (target) írja le –A túlélési görbe egy populációból,mely N darab azonos szervezetből (sejtből) áll –Ez a populáció D dózisú besugárzásnak (vagy más behatásnak) van kitéve –Matematikai egyenlettel jellemezhető A legegyszerűbb eset, ha 1 érzékeny hely van –Ha ezt sugárzás éri, akkor elpusztul a szervezet dN elpusztultak száma, amit dD dózis ért a fenti arányos a populáció besugárzás előtti egyedszámával N-el -dN/dD=kN, ahol k konstans a dózis hatékonyságának mértéke

21 Integrálás után N=N 0 D=0 (1)N=N 0 e -kD (2)A túlélők aránya S=N/N 0 (3)S=N/N 0 =(e -kD ) n itt n=1 (4)lnS a D dózis függvényében egyenest ad, melynek meredeksége –k Ez az egytalálatos (single hit) vagy exponenciális görbe

22 Mi történik, ha olyan populációnk van, melyben az egyes szervezet elpusztításához n helyet kell eltalálni a pusztuláshoz –Ebben az esetben az inaktivációhoz legalább n találatra van szükség (legalább, mert statisztikailag néhány hely 2 találatot is kap, de azt feltételezzük, hogy 2 találat ugyanazon a helyen nem hatékonyabb, mint egy találat) –Annak valószínűsége, hogy minden n cél találatot kap P n –P n =(1-e -kD ) n (független események) –A populációban a túlélők aránya S=1-P n –S=1-P n =1-(1-e -kD ) n –S=1-(1-ne -kD +…e -nkD ) (kibontva)

23 Ha a dózis (D) nagy, akkor a magasabbrendű tagok elhanyagolhatóak lesznek az ne -kD taghoz képest –Azaz nagy dózis esetén S=ne -kD –ln S=ln n – kD –Kis dózis estén S lassan változik –Nagy dózis esetén S=ne -kD érvényesül –Az egyenes extrapolációja és y tengelymetszete megadja célpontok (n, target) számát –Ha kísérletesen elég nagy dózist tudunk elérni, akkor becsülhetjük a célhelyek számát

24 Fágokra egyenes vonalat kapunk Baktériumoknál nem egyértelmű –A populáció nem egységes, egyes sejtek a replikáció más és más fázisában vannak Lehet olyan sejt, ahol több kópia is van az egyik sérül, de a másik ép marad Sok besugárzási károsodás javításra kerül, így a potenciálisan halálos találatok egy részét nem észleljük –Ionizáló sugárzás 3 típusú károsodást okozhat Egyszálú törés, legtöbbször a ligáz kijavítja 2 szálú törés, gyakran letális, mert a szabad dsDNS végek a nukleázok támadási helyei Bázisokban történt károsodás (elemi oxigént igényel), gyakran halálos, a sérült bázis akadályozza a replikációt

25 Ionizáló sugárzás esetén –A „k” konstans egyfajta mértékegysége a találat valószínűségének –Az ionizáció száma egységnyi térfogatra arányos a dózissal –V target volume (cél térfogat) –A V térfogaton belüli átlagos találatok száma cVD, c arányossági állandó, megmondja hány találatból hány ionizáció keletkezik –Véletlenszerű találatnál, n találat valószínűsége V térfogaton belül Poisson eloszlással adható meg –P(n)=e -cVD (cVD) n n! –Single hit mechanizmusban a túlélők 1 találatot kell kapjanak S=1-P(n) –S=e-cVD k=cV, azaz k arányos a cél térfogatával –Minél nagyobb a céltábla annál nagyobb a találat valószínűsége

26 k=cV; k arányos a cél térfogatával A legnagyobb genomú fág a legérzékenyebb (T5) A k értékek aránya megegyezik a DNS molekulasúlyok arányával

27 UV sugárzást tanulmányozták talán a legjobban –DNS/fehérje abszorpciós maximuma 260/280nm –Különböző hullámhosszú UV besugárzáskor a túlélési görbe hasonló kinetikájú, csak a meredeksége más –Leghatékonyabb hullámhossz a 260 nm (ez a DNS elnyelési maximuma) –UV sugárzás fő eredménye primidin dimer de főleg timin dimer (ciklo-butil-timin dimer) DNS javító mechanizmusok

28 Timin dimer hatásai –DNS hélix torzul, a timinek közötti (szálon belüli) távolság csökken –A torzulás eredménye, hogy a komplementer szálon lévő adeninekkel gyengül a hidrogénhíd kötés (maga a dimerizáció nem szünteti meg a H-híd kötés képességét) –Ez a szerkezeti torzulás megakadályozza a replikációs villa továbbhaladását

29 Hogyan blokkolódik a replikáció? –A PolIII eléri a T dimert, a replikációs villa megakad –A T dimer továbbra is képes H-híd kötésre, mert a dimerizáció nem érinti a H-híd kötésben résztvevő csoportokat –A dimer torzulást visz a hélixbe –Amikor a PolIII adenint szintetizál a szálra a T dimer miatt torzulás jön létre –A PolIII úgy érzékeli, hogy rossz párok alakultak ki –3’-5’ exonukleáz aktivitással visszalép, kivágja a „rossz” nukleotidot –A PolIII újra beépíti az adenint „helyben jár” –A replikáció elakad, a baktériumok nem nőnek

30 Hogyan indulhat újra a replikáció? –A dimer direkt kijavítása fotoreakcióval –Dimer kivágódhat, PolI beépíti a helyes bázispárt –DNS szintézis a T dimer mögött újra indulhat így a T dimer rekombinációs javítással eltűnik –SOS repair lehetővé teszi a hibás replikációt Melyek a bizonyítékok a javító mechanizmusok létére –Baktériumoknál az UV besugárzás során nem volt egytalálatos túlélési görbe A DNS mindkét szálát kell érje találat? –Kéttalálatos sem volt a túlélési görbe –Nagyon nagy dózisok esetén sem volt lineáris a görbe

31 Mi lehet az oka, hogy a target elmélet nem működik –Hatékony javító mechanizmusok léteznek Kis dózis esetén nem elég hatékony a pusztítás A dózis emelkedésével a javító rendszer is telítődik, néhány találat javíthatatlan, vagy a repair rendszer is sérül Bármelyiknek eredménye az, hogy a túlélési görbe a kezdeti lapos rész után lefele görbül –További megfigyelések A túlélő baktérium frakció növekedése, bizonyos besugárzás utáni kezelés eredményeképpen Olyan mutáns törzsek izolálása, melyek érzékenyebbek voltak a besugárzásra, mint a vad típus

32 Fotoreaktiváció –UV kezelt tenyészet, ha fényen állt több túlélő sejtet tartalmazott, ez a fotoreaktiváció Biokémiai vizsgálatok kimutatják, hogy enzimes folyamat Az enzim fotoliáz T dimereket hasítja, mellyel a monomer állapot visszaáll Az enzim inaktív mindaddig, amíg nm hullámhosszú fény nem éri Az enzimhez asszociált folsav kofaktor elnyeli a fény energiáját Az enzim ezt az elnyelt energiát használja a kötés elbontására Phr - mutáns izolálása, mely nem fotoreaktiválódik és nincs fotoliáz enzimje Más fenotípusos változás nincsen

33 UV besugárzott fágok nem fotoreaktiválódnak, mert nincs fotoliázuk –Lehet azonban fotoreaktivációt elérni –A fágot úgy kell adszorbeálni a baktérium sejtekre, hogy a baktériumokban gátolt legyen a szaporodás –A fág DNS bejut a baktériumsejtben, de a szaporodás gátolt –Fény hatására a baktérium fotoliáza kijavítja a fág DNS-ét is, gazda sejtes reaktiváció (host cell reactivation)

34 Sötét javítás –liquid-holding javítás –Az UV fénnyel besugárzott sejteket nem tápanyagforrású pufferben több óráig tartva (sötétben) a túlélők száma növekszik –Phr- mutánsban is van liquid-holding recovery –Fény nélkül megy végbe Két rendszer tehát az E. coliban –Fotoreaktiváció –Fénytől független javító rendszer Alátámasztás –Mutáns E. coli Bs törzs, amely UV érzékeny »Normál fotoreaktiváció »Sötétben (liquid holding reaktiváció) nincs »coli Bs törzsben nincs gazdasejtes reaktiváció, és az UV besugárzott T1 fág túlélési görbéje meredekebb a Bs törzsben

35 Sötét javítási rendszerben mutáns coli előállítása (Bs elérhető volt, de genetikai analízis akkor még nem volt baktériumokra) –K12 törzsből a host cell reaktivációt használva UV besugárzott T1 fágot és mutagenizált colit szélesztettek Ahol működik a gazdasejtes reaktiváció, ott a T1 fág növekszik és a baktérium elpusztul Ahol nem volt gazdasejtes reaktiváció ott a baktérium növekedhetett (a T1 nem javítódik) A kinőtt baktériumokat tesztelték UV érzékenységre

36 A mutánsok komplementációjával 3 osztályt kaptak –uvrA, uvrB, uvrC –Biokémiai analízis azt mutatta, hogy defektívek a T dimert kivágó endonukleázra Más mutánsok (recA, recB, recC mutánsok) esetén azt tapasztalták, hogy a recA - UV érzékeny, de a T dimereket javították DNS replikációban (PolI) hiányos mutáns szintén UV érzékeny

37 A T dimerek eltávolításáért E. coliban 4 fő út felelős –Fotoreaktiváció –Sötét javító mechanizmus Excíziós (kivágásos) javítás Rekombinációs javítás SOS javítás, SOS válasz (károsodás) Excíziós javítás –A legtöbb javítás alapja a T dimer eltávolítása a DNS-ből –Nem fotoreaktiváció Bizonyíték –UV besugárzott baktérium –Liquid holding reaktiváció –T dimerek száma csökken (biokémiai vizsgálattal) –T dimerek jelennek meg a sejten belül és kívül

38 A kivágásos javítás több enzimes lépésből álló folyamat –Kétféle módszer az első bevágásnál coli T dimer két végénél vág (8 nukleotiddal az 5’ vég felé és 3-5 nukleotiddal a 3’ vég felé M. luteus T (pirimidin) dimer glikoziláz –Kivágódik a T dimer rész –PolI szálkicserélődés –Egyszálú rész nukleáz hasítás –Ligáz összekapcsolja a szálakat

39

40 coliban a bemetszést az Uvr rendszer végzi –UvrA köti a torzult hélixet –UvrB köt a fenti komplexhez –UvrC a fenti komplexhez kötődve hasítja a DNS-t Az Uvr rendszer más javítást is végez –T dimer –Bázis eltolódás –Nagyobb molekula beépülése (interkaláció) –Az enzim komplex valószínűleg a hélix torzulását ismeri fel

41 Methyl directed mismatch repair (olyan javítás, ahol a DNS kicsit torzul) –DNS replikáció –PolIII editáló funkciója, rossz beépülés esetén visszalép egyet és kijavítja rossz bázist –A mismatch repair még egy biztosíték a hibátlan replikációra Mi történik, ha mégis beépül egy rossz bázis Honnan tudja az enzim, hogy melyik szálon van a „rossz” bázis A szülői szál metilált, az utód szál (egy ideig) nem metilált A metilált szál szolgál templátul mutS, mutL, mutH gének mutánsai növelik a spontán mutáció arányát dam gén adenin metiláz GATC >GA*TC, ha hibás nem működik a rendszer

42 A MutS köti az apró torzulást tartalmazó DNS darabot A MutH két molekulája a MutS-hez köt, a DNS átcsúszik és egy hurok jön létre Addig csúszik a DNS, amíg a MutH hemimetilált GATC-hez nem érkezik (mindkét oldalon) A nem metilált szál degradálódik Az új szálat a PolIII szintetizálja A komplexben a MutL is ott van, de funkciója nem ismert

43 Rekombinációs javítás –Sejtések Ha a sötét javításért csak az excíziós javítás felel, akkor kevés T dimer is letális lenne, ezzel szemben T dimer kell a letális dózishoz, azaz van más repair mód is recA mutánsok UV érzékenyek Ráadásul a mindkét rendszerben mutánsok (uvr+recA) érzékenyebbek, mint az egyszeres mutáns T dimer kialakul Replikációs villa megakad Tovább indul a dimer után Ez a poszt-dimer iniciáció, a DNS replikáció újra indul Az utód szálon folytonossági hiányok a T dimer után (mintha Okazaki fragmensek lennének) Ez a folyamat azonban még nem elég a normális replikációhoz, mert az utód szálon hiányok vannak

44 Sister strand exchange A defektustól mentes egyszálú DNS kerül a kivágott T dimer helyére Ehhez a RecA fehérjére van szükség PolI szintetizálja az új szálat A ligáz összekapcsolja a fragmenseket A donor molekulából kivágódott egyszálú szakaszt a PolI javítja, a ligáz összekapcsolja Ha minden dimer kijavításra kerül 2 komplett szál keletkezik Probléma, ha a két komplementer (ellentétes) szálon, egymáshoz közel vannak T dimerek, akkor nincs jó donor molekula

45 két szál közötti keresztkötést az UvrABC rendszer és rekombinációs repair együtt oldja meg A rekombinációs javítás előnye, hogy A replikáció tovább folytatódhat, nem kell megvárni, amíg minden T dimer javításra kerül Olyan hibák is javíthatók, melyek nem okoznak nagy hélix torzulást Excíziós javítással szemben ez poszt- replikatív vagy daughter strand javításnak hívják Fágoknál is létezik: recA - törzsön, az UV besugárzott fágok rosszabbul szaporodnak

46 Kimutatták, hogy az UV besugárzás erős mutagén Az eddigi rendszerek azonban tökéletesen kijavították a hibákat, nincs mutagén hatás Az UV mutagenezis nem arányos a dózissal, csak nagyon erős UV dózis okoz mutagén hatást Ha az UV dózis során a T dimerek száma túllépi a javító mechanizmus kapacitását, egy másik rendszer lehetővé teszi a túlélést, de annak árán, hogy mutáció(k) jön(nek) létre Ez az SOS válasz –Legutolsó mentsvár Lehetővé teszi a replikációt –A ki nem javított DNS indukálja ezt a választ –Az SOS elkerülő válaszreakció –A DNS szál replikálódik, de hibákat halmoz fel –A legtöbb mutagén hatásért ez a rendszer a felelős

47 A SOS válasz szabályozása –SOS válasz kb. 20 gén koordinált szabályozott működését jelenti kiterjedt DNS károsodás esetén –A lambda indukció és RecA fehérje közötti kapcsolat felfedezése volt a kulcs az SOS felfedezéséhez A mérsékelt fág lizogén és lítikus ciklusa Profág integrálódik a gazda kromoszómájába A baktérium amely hordozza a profágot a lizogén A profág a cI represzort termeli A represszor molekula megakadályozza, hogy a fág lítikus ciklusba kerüljön UV fény hatására azonban indukálódik a fág Ez a lizogén indukció, a fág replikálódik, megöli a gazda sejtet, lizálja és kiszabadul A süllyedő hajó esete –A fág érzékeli, hogy a gazda elpusztul –Még mielőtt a gazda elpusztul kivágja magát, replikálódik, kiszabadul és újabb gazdasejtet fertőzhet, azaz túlél Lizogén indukció csak nagy UV dózisnál fordul elő, amely indukálja az SOS választ, tehát a lambda fág indukciója része az SOS válaszreakciónak

48 A recA mutáns sejtek különösen érzékenyek az UV fényre A recA-ra szükség van a rekombinációs hatásnál –A rekombinációban mutáns recBC sejtek UV tűrők A recA-nak szerepe van más UV javításban is A recA mutánsokban az UV nem volt mutagén (nagyobb dózisra több sejt pusztult el, de a mutációk száma nem nőtt) A recA-ra szükség van az SOS válaszban –recA mutánsokban nem lehet SOS választ kiváltani –recA mutánsokban nem lehet UV fénnyel lambda fágot indukálni Vizsgálták a lambda cI represszort –UV besugárzás után a cI represszor kettéhasadt recA mutánsban a cI intakt recA proteáz aktivitással rendelkezik –Kimutatták, hogy a RecA fehérje egyszálú DNS és ATP kötése után átalakul proteáz formájúvá RecA*, a RecA* bontja a cI represszort, a profág indukálódik –Később kiderült, hogy a RecA* nem proteáz, hanem csak elősegíti a cI represszor autokatalitikus aktivitását

49 A RecA* fehérje elősegíti az SOS válaszban szereplő más fehérjék autokatalitikus aktivitását A RecA szerepe az SOS válaszban –Direkten gátolja a polIII editáló funkcióját, mert erősen köt a pirimidin dimer által torzított DNS szálhoz A polIII eléri a dimert, amelyhez RecA kapcsolódott A RecA kölcsönhatásba lép a polIII exonukleáz alegységével Gátlódik az editáló funkció A replikációs villa tovább halad (UV hatására a T dimerrel szemben adeninek épülnek be, de a torzulás miatt más is beépülhet A hiba nem editálódik, és a mutáció kialakul

50 Az umuDC gének termékei is szükségesek a hibával terhelt (error prone) replikációhoz (az abban mutánsok nem mutagenizálódnak) –Az aktivált RecA fehérje elősegíti az UmuD fehérje autokatalitikus bomlását (UmuD’ keletkezik, aktív C-terminális rész) –UmuD’+UmuC a RecA fehérjével együtt hozzájárulnak a hibás polimerizációhoz –UmuDC gyakran plazmidon található –UmuDC nélkül az UV besugárzás nem mutagenizál

51 SOS indukció –DNS károsodásra indukálódik –UV reaktiváció jelensége (W, Weigle reaktiváció) Nagy dózisú UV-vel besugárzott fágot titrálunk –UV besugárzott baktériumon > több plakk –UV nem besugárzott baktériumon > kevesebb plakk A túlélő fágok DNS-e mutációkat tartalmazott –UV besugárzás aktiválja az SOS választ (csak recA+) –Mivel hibával terhelt az SOS válasz, ezért be/ki kapcsolhatónak kell lennie, hogy a hibák ne halmozódjanak fel A válasz csak bizonyos DNS sérüléseknél kell Néhány jellemzőnek kell indukálnia a javítást, de az összes SOS gént kell bekapcsolnia (ez a regulon, azaz olyan operonok készlete, amelyek közösen szabályzódnak)

52 Az SOS szabályzó rendszernek két összetevője van a lexA és recA géntermékek –A lexA gén az összes SOS operon represszora, a LexA fehérje az összes gén előtt található közös operátorra köt, és gátolja az expressziót –A LexA a lexA operátorához is kötődik, azaz saját magát is szabályozza –A RecA fehérje bekapcsolja az SOS választ a LexA fehérje autokatalízisének elősegítésével (mint a cI represszor) –A DNS sérülés konformációs változást okoz a RecA fehérjében (RecA*) ez segíti a LexA autokatalízisét Amikor sérülés van, az SOS bekapcsolt állapotban van hogyan:? –Sérülés RecA->RecA* –A LexA érzékeny a proteolízisre –lexA saját magát szabályozza

53 Normál sejtben RecA normális nem segíti a LexA bomlását LexA nem bomlik LexA represszálja az SOS génjeit LexA represszálj a lexA gént UV hatására a sejtben A RecA egyszálú DNSt köt (a T dimereknél felnyílt rész) RecA>RecA* RecA* segíti a LexA autokatalízisét LexA elhasad SOS géneket nem represszálja a LexA lexA gén is derepresszál, indukálódik 50x aktivitás változás

54

55 Mindezek általános javító rendszerek voltak (kivéve a fotoreaktivációt) Léteznek ún. speciális javító rendszerek –Bázis dezamináció –Reaktív oxigén károsodás –Alkiláció Adaptív válasz Meg kell különböztetni a DNS sérülést és mutációt –A DNS sérülés önmagában nem mutagén, csak akkor válik azzá, ha sérülés következtében olyan változás keletkezik a DNS-ben mely tovább öröklődik

56 Bázisok dezaminálása –A bázisokban található (adenin, guanin, citozin) amino csoportok sérülékenyek, spontán vagy kémiai behatásra eltávolíthatók Adenin dezaminálva hipoxantin Guanin dezaminálva xantin Citozin dezaminálva uracil –Mutagén, mert rossz bázispárosodást okoz Pl adenin dezaminálódik, hipoxantin lesz belőle ez citozinnal párosodik AT ből CG tranzíció keletkezik –Dezamináló ágensek Hidroxilamin (citozin) Biszulfit (citozin) Salétromos sav

57

58 Dezaminált bázisok javítása –DNS glikozilázok Hasítják a módosított bázist a nukleotid cukorjában –Minden bázisra specifikus glikoziláz –Amikor a bázis nincs a szálon, az AP (apurin, apirimidin) endonukleázok hasítják a cukor- foszfát láncot –A hasítás után a szabad 3’OH indítja a PolI javítást coliban

59 Very short patch repair (VSR) dezaminált 5 metil citozin javítása –Metil csoport védi a DNS-t restrikció ellen –Magasabbrendűekben génszabályozó szerep –Dezamináció során uracil helyett timin keletkezik, azaz mutagén hely –A legtöbb metil citozin a 5’CCWGG3’/3’GGWCC5’ szekvenciában a második citozin (W=AT v. TA) –A másik citozint a Dcm (DNS citozin metiláz metilálja) CmCAGG/GGTCmC szekvencia –Ez sérülékeny, ezért a coli repair rendszere kijavítja ezt a szekvenciát, ha a Cm helyett T jelenik meg –Ebben a rövid szekvenciában a vsr gén VSR endonukleáza a TG mismatchhez köt és a T mellett hasít, ezután PolI javítja a szálat –Nagyon speciális csak ebben a szekvenciában javítja a TG mismatch-et

60 Reaktív OXIGÉN-ek –Ezek közül a legmutagénebb a 7,8-dihidro-8- oxoguanin (8-oxo-G, GO) –Gyakran adeninnel párosodik –mutM, mutY, mutT gének termékei játszanak szerpet –MutM N-glikoziláz, mely specifikusan eltávolítja a GO bázist, a dezoxiribóz cukorról Itt a MutM el is hasítja a szálat más esetben exonukleáz hasítja –MutY N-glikoziláz, de nem GO-t, hanem a vele szembe beépült adenint távolítja el, a többit más repair rendszer végzi el. –MutT megakadályozza, hogy 8-oxoG kerüljön a DNSbe, a d8-oxoGTP-t hidrolizálja

61 Alkiláló ágensek –A bázisok és a foszfát is alkilálódhat –Alkiláló ágensek alkil csoportot CH3, CH3CH2 ragasztanak a foszfát csoporthoz, vagy bázisokhoz Pl. etil-metán-szulfonát (EMS, mustágáz, metil-metánszulfonát, N- metil-N’-nitro-N-nitrozoguanidin, NTG) –Guanin N7 és adenin N3 a legérzékenyebb –Az alkilált bázis hajlamos rossz bázispárosodára Javító rendszerek –Specifikus N-glikozilázok, az alkilált bázis levágódik, AP endonukleáz hasít, exonukleáz degradáció, PolI javítás alkA gén –Metil transzferázok (O6 metil-guanin, O4 timin) Az alkil csoportot eltávolítják, miközben maguk metilálódnak Nem igazi enzimek, mert nem katalizálják a folyamatot, hanem felhasználják magukat

62 E. coli adaptálódik alkiláló ágensek hatására –NTG kezelés (kis mennyiség) után a sejt képes tolerálni nagyobb mennyiségű alkiláló ágenst –Számos gén aktiválódik amelyek szerepet játszanak az alkiláló ágensek okozta sérülések javításában Szabályozás (néhány kópiától több ezerig) –Az Ada protein metilációja a fő szabályozó Két helyen metilálódhat Az egyik hely O6-metilguanin, O4-metiltimin-től vesz fel metil csoportot, a másik foszfát csoportról Bármelyik helyen vesz fel metil csoportot több metil csoport nem kötődhet AdaC terminális részen metil csoport metG, metT-től, nem enged több metilációt önmagán>öngyilkos inaktiváció Az ada N terminális részen, ha felvesz metil csoportot a foszfát vázról, akkor az Ada fehérje aktiválja saját génjét, csakúgy, mint más adaptív válasz génekét.

63 Összefoglalás Genom integritást védő mechanizmusok –Restrikció-modifikáció Restrikciós-modifikációs rendszerek –Javító mechanizmusok DNS sérülések DNS repair folyamatok –Általános javítófolyamatok »Excíziós »Methyl directed mismatch repair »Rekombinációs repair »SOS rendszer –Speciális javítórendszerek »Fotoreaktiváció »Dezaminált bázisok javítása »Very short patch repair »Reaktív oxigén okozta károk javítása (oxo-guanin) »Alkiláció (adaptív válasz)

64 MUTÁCIÓ

65 A korai mutáció következménye

66 Valószínűség Valószínűség: az, hogy valami történni fog, bekövetkezik. Például ma éjszaka csillagos lesz az ég. Definíció szerint –0,0 azt jelenti, hogy soha –1,0 azt jelenti, minden alkalommal bekövetkezik Mit jelent a 0,5 –es érték? Mi a valószínűsége, hogy fej lesz egy normális pénzdarab feldobásának eredménye? Mi a valószínűsége annak, hogy 3-ast dobunk egy kockával?

67 Nem független események –Mi a valószínűsége annak, hogy 4-est dobunk, majd 6-ost? –Ha a mutációs ráta /sejtosztódásonként, mi a valószínűsége annak, hogy két mutáció lesz ugyanabban a sejtben? Független események –Mi a valószínűsége annak, hogy vagy 4-est, vagy 6-ost dobunk? –Mi a valószínűsége annak, hogy a trpA, vagy pedig a trpB génben lesz mutáció?

68 Permutáció Fontos az események sorrendje –P=? 4, majd 6 –P=? 6, majd 4 –Két különböző permutáció

69 Kombináció Hány permutáció lehetséges, ha egy dobókockát kétszer dobunk el? –6 kimenetel az első dobásra –6 lehetőség a másodikra is –36 permutáció P=?, hogy két dobásra 4 és 6 –Bármelyik két permutáció lehet: 4, 6; 6, 4 –Ugyanaz a kombináció

70 Születésnap probléma Mi a valószínűsége annak, hogy itt a teremben két ember ugyanazon hónapban és ugyanazon a napon van a születésnapja? –Nehéz kiszámítani –Könnyebb az ellenkezőjét. Mi a valószínűsége annak, hogy nincs két azonos születésnap? –365/365 * 364/365 * 363/365…*353/365 = 78% –Igy annak a valószínűsége, hogy két embernek ugyanaz a születésnapja (1–0,78 )*100 = 22%

71 Binomiális eloszlás Gyakran két eseménnyel dolgozunk –Sikeres (S) / sikertelen (N) –A sikeres kimenetelt önkényesen definiáljuk –P (siker) + P (sikertelen) = 1,0 S + N = 1 S 2 + 2SN + N 2 = 1 (két független esemény) Általános öf: (S+N) n =1, ahol n a próbálkozások száma Gyorsan bekövetkezik, hogy nehéz pontosan kiszámítani

72 Poisson eloszlás A binomiális kiterjesztés közelítő meghatározása –Könnyebb vele számolni –Csak akkor érvényes, ha a mintaszám n nagy és a siker valószínűsége, P(S) kicsi –m = várható érték = np –A siker r exakt értéke kiszámítható –P r =e –m m r /r! –0! =1

73 Mutációs ráta A fluktuációs teszt redményei felhasználhatók –A csövek hány százalékában nem volt mutáns? –Ez lesz a P r=0 –Oldjuk meg az egyenletet m-re. –Ha tudjuk szélesztett sejtek számát, akkor p kiszámítható, azaz a mutáció valószínűsége A mutációs ráta általában 10 – –8

74 Poisson eloszlás Target elmélet. P x annak valószínűsége, hogy egy gént (target) pontosan x találat ér. h átlagos találatszám per target P x meghatározásának legegyszerűbb módja: nincs mutáció P 0 értékének meghatározása és behelyettesítése a fenti egyenletbe.

75 Mutációs ráta, mutáns gyakoriság Mutációs ráta (a), összes sejt a tenyészetben (N), mutánsok száma (h) Mutációs rátát nehéz meghatározni, ezért sokkal gyakrabban a mutáns gyakoriságot adják meg = mutánsok aránya a tenyészetben A spontán mutációs ráta E. coli-ban 1/300 kromoszóma replikáció (hipermutabilitás!!)

76 Példák a mutációs rátára Emlősökben viszonylag konstans mutációs ráta sok génnél.

77 Szelekció és a lappangások Fenotípusos lag (recesszív mutáció) Szegregációs lag (domináns mutáció) Mutáció a replikálódó DNSben Nincs mutáns fenotípus, mert a citoplazmában még van wt géntermék Először jelenik meg a mutáns fenotípus Kész a replikáció 1. Sejtosztódás 2. Sejtosztódás Mutáns sejtek száma nő Vad típ sejtek A mutáns fenotípus akkor jelenik meg, ha a wt géntermék kellően kihígul, vagy eltűnik. A mutáns sejtek száma a következő osztódásnál kezd nőni.

78 Grafikus példa Sejtek az exponenciális fázisban szaporodnak Konjugációs géntranszfer Lag

79 Mutáns dúsítás penicillinnel Hogyan találjuk meg a hiánymutánst (auxotróf)? –Közvetlen szelekció általában nem lehetséges –Gorini penicillint (vagy származékait) használta A penicillin a sejtfalszintézist gátolja –Az eredmény Protoplaszt G(+) sejt sejtfal nélkül Spheroplast G(–) sejt minimális sejtfallal –Ha éheztetjük a szükséges tápanyagra, akkor a hiánymutáns biztonságban van, mert nem tud növekedni

80 A genetikai kód Univerzális? –nagyjából –A mitokondriumokban kicsit különbözik UAA trp-t kódolhat a transzlációs STOP helyett A kód nagyon redundás –Crick wobble hipotézis A harmadik bázis kis különbséget jelent Ha az első két bázisnál 6 H híd, akkor a harmadik irreleváns

81 Kód Az ORF start kodon ÁLTALÁBAN AUG, de lehet GUG is Az első aminosav a metionin –Csak egy kodon –Ezért a szövegkörnyezet hatása Némely szignál közelében az AUG azt jelenti, hogy „itt kezdődik a transzláció” Az AUG máshol a metionint jelenti

82 Mutáció típusok BÁRMILYEN változás a DNS szekvenciában mutáció Szubsztitúciók –Vad szekvencia AGC (Ser) –CsendesAGT (Ser) –MisszenszGGC (Pro) –NonszenszATC (STOP) Deléció/Inzerció AGGC InverzióCGA

83 Frameshift mutáció Minden 3-al nem osztható bázis addíció, vagy deléció –sok sör árt –sok srá rt… (1 bázisnyi deléció) –A frameshift eredményeként downstream értelmetlenség 3-al osztható bázisnyi addíció, vagy deléció az adott helyen megváltoztatja az aminosavat, de downstream a kód változatlan –sok sör árt –bor nem sok sör árt

84 Szupresszor mutációk A második mutáció érvényteleníti az első hatását –Nem reverzió, hanem érvénytelenítés –Lehet ugyanabban a génben (intragénes), vagy egy másik génben (intergénes) –Intragénes +1 frameshift-et érvényteleníti egy –1 frameshift Rossz folding-ot kompenzálja egy másik változás –Intergénes Általában tRNS mutáció A rossz kodonhoz a jó aminosavat szállítja

85 Mutagének Kémiai, vagy fizikai → DNS sérülést okoznak –Hiba a repair folyamatokban Többé kevésbé véletlen Szokatlan típusok –transzpozonok –mutátor mutációk

86

87

88 MutagénMechanizmusOkozott mutáció típusa Spontán DNS replikáció és repair hiba, a nukleotidok spontán modifikációja Minden mutáns típus UV sugár Primidin dimer, error prone repair-t (SOS) indukál Főleg G-C → A-T tranzíció, de minden más is, deléció, frameshift és kromoszóma átrendeződés, de kisebb gyakorisággal 2-amino- purin (2AP) Bázis analógA-T →G-C és G-C → A-T tranzíció 5-bróm- uracil Bázis analógG-C → A-T és A-T → G-C tranzíció Hidroxi- lamin (NH 2 OH) Alkiláló ágens, N 4 -hidroxicitozint készít G-C → A-T tranzíció in vitro használva

89 N-metil-N'-nitro- N-nitrozoguanidin (MNNG) Alkilez, O 6 -metilguanint készít G-C → A-T tranzíciók, többszörös, közeli mutációk, Rep. villában Etilmetán szulfonát (EMS) Alkilez, O 6 -metilguanint készít G-C → A-T tranzíció Etiletán Szulfonát (DES) Alkilez, SOS választ indukál G-C → T-A transzverzió, más báziszubsztitúciós mutációk Salétromos savOxidatív dezaminálás G-C→ A-T és A-T →G-C tranzíciók, deléciók kisebb gyakorisággal ICR-191 Interkalálódó, akridin származék a kihurkolódott bázisokat közé beépülve stabilizál Frameshift, többnyire addíció, vagy deléció a G, vagy C ismétlődéseknél

90 Helyspecifikus mutagenezis Site-Directed Mutagenesis Egyszálú templát Egyszálú komplementer primer szándékos mismatch Nukleotidok a szintézishez: dATP, dGTP, dTTP, 5-metil-dCTP T7 DNS polimeráz és DNS ligáz methyl- -methyl Nem metilezett DNS vágása MspI enzimmel. Fragmantumok eltávolítása exoIII-mal. Klónozás, vagy elektroporáció.

91 Repair rendszer mutáns Mutációs gyak. növekedés Fő mutáció típusok Mismatch repair mutH SL tranzíció, frameshift Proofreadin g mutD tranzíció, transzverzió, frameshift G-A mismatch repair mutT AT → CG transzverzió G-A mismatch repair mutY> 10 2 GC→TA transzverzió mutD = dnaQ, DNS pol III ε alegység, proofreading

92 Mutagén dózis Mutagének alkalmazásakor figyelembe venni: –Mutagén kémiai reaktivitása a DNS-sel –A mutagén és a cél DNS koncentrációja –A kezelés időtartama Többszörös mutánsok kerülendők (Poisson) Letális mutációk Fenotípusos lag-ra figyelni szelektív táptalajra szélesztés előtt

93 A mutagén dózissal nő a kívánt mutánsok száma, de a sejtek pusztulása is, ezért a keresett mutás száma csökken. Egyensúly!!!


Letölteni ppt "A baktérium genom integritását védelmező rendszerek restrikció modifikáció DNS sérülés DNS javítórendszerek."

Hasonló előadás


Google Hirdetések