Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT, TRANSZGENIKUS ÉS GÉNKIÜTÖTT ÁLLATOK. KLÓNOZÁS Dr. Jánossy Tamás SZTE, ÁOK, Sebészeti Műtéttani Intézet.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT, TRANSZGENIKUS ÉS GÉNKIÜTÖTT ÁLLATOK. KLÓNOZÁS Dr. Jánossy Tamás SZTE, ÁOK, Sebészeti Műtéttani Intézet."— Előadás másolata:

1 KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT, TRANSZGENIKUS ÉS GÉNKIÜTÖTT ÁLLATOK. KLÓNOZÁS Dr. Jánossy Tamás SZTE, ÁOK, Sebészeti Műtéttani Intézet

2 Modellválasztás az orvostudományi és a biológiai kutatásokban 1. A megfelelő állatfaj kiválasztása: Leggyakrabban használt állatfajok: Háziállatok: szarvasmarha, sertés, baromfi, kutya, macska Nem ember főemlősök: majom, csimpánz, cerkófmajom, selyemmajmok Kis laboratóriumi emlősök: egér, patkány, tengerimalac, hörcsög, nyúl Ezek a leggyakoribbak: kis helyigény, szaporaság, rövid tenyészidő 2. A megfelelő genetikai tényezők, tulajdonságok kiválasztása: pl. változatos v. azonos állatok

3 Kültenyésztés: a rokontenyésztés elkerülése genetikailag változatos állomány <100 tenyészpár: a rokontenyésztés maximális elkerülése >100 tenyészpár: rotációs v. találomra történő (random tenyésztés) A beltenyésztési együttható (a homozigóta génhelyek gyakoriságának) növekedése: <1% A kültenyésztett (outbred) állomány egyedei heterozigóták : az apai (A) és az anyai gének (B) alléljei a génhelyek túlnyomó részében különbözőek (AB). A populáció anizogén : egyedei genetikailag különböznek (változatos genotípusúak).

4 Zárt kültenyészetben is megfigyelhető a növekvő homozigótaság. Egyensúlyban lévő zárt tenyészetben az egyedek fele heterozigóta (AB), másik fele homozigóta (25% AA, ill. 25% BB) Rokontenyésztés: 4 nemzedéken belüli közös ős a családfában Beltenyésztés: szigorú rokontenyésztés: sorozatos testvér-testvér, gyermek-szülő pároztatás  növekvő homozigótaság (genetikai sodródás) (AB helyett AA v. BB) Beltenyésztett törzsek létrehozása: >20 nemzedéken át végzett testvér-testvér (szülő- utód) pároztatás  az összes génlokusz 98,4%-a homozigóta (F=98,4%) A beltenyésztett (inbred) törzs egyedei homozigóták és izogének (azonos genotípusúak).

5 A törzs bármely tagja elfogadja a bármelyik másik azonos nemű tagjából átültetett szöveteket (graft)  az izogenitás ellenőrzése bőrtranszplantációval (Silvers-féle körtranszplantáció) Fenntartása: a ritka mutációk miatt testvér-testvér pároztatással.

6 A beltenyésztett rágcsálótörzsek története: Jensen, Loeb, Ehrlich, Tyzzer: spontán egértumorok sorozatos transzplantációval történő fenntartása  többnyire sikertelen (nem eredt meg v. visszafejlődött) Jensen (1903), Loeb (1908): sikeres sorozatos tumorátoltások viszonylagosan beltenyésztett egerekben  a tumorokkal szembeni fogékonyság örökletes Little (1914): a tumorrejekció, ill. a fogékonyság több dominánsan öröklődő génen alapul  a hisztokompatibilitási gének, a celluláris immunválasz tanulmányozása Rommel, Wright (1906): beltenyésztett tengerimalacok (2-es és 13-as törzs)

7 King (1909): beltenyésztett patkányok (PA, WKA törzsek) Little (1909): beltenyésztett egerek (DBA/1, DBA/2 törzsek) Bagg (1913): BALB/c egértörzs Strong (1920): A, C3H, CBA egértörzsek Little (1921): C57 egértörzsek családja : a leggyakrabban használt egér- és patkánytörzsek kifejlesztése 1929: A Jackson Laboratórium megalapítása (Little)

8 Beltenyésztési depresszió (leromlás): a szaporodási képesség, életképesség, egészség stb. csökkenése Csak az első néhány generációban fordul elő. Oka: a káros recesszív gének homozigótasága A kialakult törzsben már nem fordul elő. F 1 hibridek: két genetikailag különböző beltenyésztett törzs keresztezéséből származó első generáció Minden egyed izogén és heterozigóta mindazon génlokuszokra, amelyekben a két szülői törzs különbözik (= a gének kodomináns öröklődése és kifejeződése).

9 Ha két transzplantációs antigénekben (H Ag) eltérő törzset keresztezünk, az F 1 -ek mindkét szülő H Ag-jeit kifejezik → ezért az egyik szülői törzstől származó bőrgraftot sem lökik ki, a szülői törzsek viszont kilökik az F 1 graftokat.

10 Hibrid „életerő” vagy heterózis: a beltenyésztési depresszió ellentéte  a káros recesszív gének elfedése a kialakuló heterozigótaság miatt. Nevezéktan: Nómenklatúra Bizottság (1952) Törzsnév: 1-4 nagybetű Egér: A, AKR, CBA, DBA stb. Patkány: LEW, WAG, BN, PVG stb. Számok csak a korábban elterjedt törzsek esetén engedélyezettek (pl. egér: C3H, C57BL; patkány: F344, AS2, M520)

11 Altörzs: - a törzs két v. több ágra oszlik a testvérpároztatás között - ugyanabban a tenyészetben két párhuzamos vonal genetikailag eltér. Példák: C57BL/6, C57BL/10; CBA/J, CBA/Ca; A/He, A/J stb. Alvonal: - egy másik laboratóriumban történő hosszú tenyésztés - a törzs bármilyen manipulációja Altörzs, alvonal neve: törzsnév/altörzs, alvonal szimbólum(ok) történeti sorrendben (a tenyésztő v. a laboratórium nevének rövidítése, ritkán szám: pl. C57BL/10ScSn: Sc=Scott, Sn=Snell

12 Manipulációk: f: dajkaság (foster nursing) egy másik törzsnél: pl. C57BL/10ScSnfC3H. Pl. specifikált patogénmentes (SPF)ntörzsek létrehozása a magzatok méhhel együtt történő eltávolítása és dajkaságban történő felnevelése révén e: embriótranszfer egy másik törzsbe h: mesterséges táplálás ( hand rearing) o: ovárium-transzplantáció p: petesejttárolás (preservation ) cseppfolyós nitrogénben Rövidített törzsnevek: AKR=AK, BALB/c=C, C3H=C3, C57BL=B, C57BL/6=B6, C57BL/10=B10 F1 hibridek elnevezése: (nőstény szülői törzs x hím szülói törzs)F 1 : (BALB/c x C57BL/6)F 1 =CB6F1

13 Koizogén törzsek: Mutáció egy jelentős génlokuszon egy beltenyésztett törzsben  egy új beltenyésztett törzs kialakítása a mutációt hordozó állatokból Az új törzs csak egyetlen génlokuszban (a mutált génben) különbözik az eredetitől  a génmutáció fenotipikus hatása tanulmányozható. A mutáció betegség alapját képezheti: Egér: Anémia: sla gén Diabétesz és elhízás (obesity): db, ob gének Anyagcsere-betegségek: his (hisztidinémia), pro (prolinémia) Vesebetegség: kd gén Izomsorvadás (dystrophia): dy, dy2J gén

14 Farok (tail) fejlődési rendellenességek: t-allél Szőrtelen (nude) és tímuszhiányos: nu Patkány: Diabetes insipidus: di gene Szőrtelen (nude) és tímuszhiányos: rnu gén Bilirubinémia: j gene Nevezéktan: törzsnév/altörzsnév-mutáns gén neve: BALB/c/Rij- nu, C57BL/6J- ob Kongenikus, ill. kongenikus rezisztens törzsek: - A kívánt gén ( D ) bejuttatása egy beltenyésztett donor törzsből (2.) egy másik, ( d génallélű) recipiens törzsbe (1.) keresztezéssel  F 1 hibridek létrehozása; - az F 1 -ek visszakeresztezése az 1. (recipiens) törzsű egerekkel; - a D gént hordozó utódok ( Dd ) szelekciója és visszakeresztezése 1. egerekkel.

15 Legalább visszakeresztezés szükséges  majd egy Dd heterozigóta hím és nőstény pároztatása  ezután egy DD homozigóta hím és nőstény beltenyésztése: az új, kongenikus törzs hordozza a donor D gént, míg az összes egyéb génjei (háttérgének) azonosak a recipiens (1.) törzsével.

16 Kongenikus rezisztens törzsek: a bőr-, ill. tumorgraftok rejekcióját kiváltó antigének génjeinek (MHC) bejuttatása a recipiens törzsbe Nevezéktan: recipiens törzs.donor törzs (gyakran rövid nevekkel): pl. B10.D2 génrecipiens: C57BL/10 (B10) (MHC= H-2 b ), géndonor: DBA/2 (D2) (MHC= H-2 d )  kongenikus rezisztens törzs = B10.D2 (másik elnevezés: C57BL/10ScSn- H-2 d ) A B10.D2 ( H-2 d ) törzs kongenikus a B10 ( H-2 b ) törzzsel: csak a H-2 lokuszban térnek el, háttérgénjeik azonosak. A H-2 felfedezése = az egér fő hisztokompatibili- tási komplexe [major histompatibility complex (MHC)] H-2 kongenikus törzsek közötti transzplantáció: az MHC felelős a graftrejekcióért.

17 Rekombináns törzsek: két nem rokon beltenyésztett törzs keresztezésével létrehozott F 2 generációból származnak, >20 generáción át végzett testvér- testvér pároztatással állítják elő őket. Elnevezés: BALB/c (C) x C57BL/6 (B6)  CXB vonalak Mindkét ős génjeit hordozzák random eloszlásban. Poligénes tulajdonságok tanulmányozására alkamasak: pl. élettartam, morfológiai és fiziológiai jellemzők, betegségek, viselkedés, gyógyszerhatások stb.

18 Transzgenikus állatok: - idegen DNS-szekvenciák = transzgének bejuttatása megtermékenyített petesejtek pronukleuszaiba - a petesejt bejuttatása álterhes nőstények petevezetékébe - a transzgént kifejező transzgenikus állatok kiválasztása és homozigóta vonal kitenyésztése. A transzgéneket ki lehet fejeztetni: - meghatározott szövetekben a megfelelő regulátoros szekvenciákhoz való kapcsolás révén (pl. antigénreceptor-gének lymphocytákban) - gyógyszerekre v. hormonokra (pl. tetraciklin, ösztrogén) válaszoló promoterekhez kapcsolva

19 A transzgenikus állatokat lehet használni: - a transzgén élettani, patológiai hatásainak vizsgálatára; - betegségmodellként; - transzgenikus fehérjék/peptidek (gyógyszerek, hormonok stb.) nagy mennyiségben történő előállítására. Génkiütött állatok: Gének célzott mutációja v. szétrombolása homológ rekombináció révén: a kiütésre használt működésképtelen exogén génkonstrukció az endogén génnel homológ szekvenciákat tartalmaz  rekombináció  a kódoló szekvenciák diszrupciója  a génexpresszió és/vagy -funkció megszűnése, deléciója A génfunkció i n vivo tanulmányozása

20

21 Klónozott állatok: Klón: az utód genomja teljesen azonos a kiinduló egyedével. Sejtosztódások (pl. megtermékenyített petesejtek és testi sejtek osztódása  a kiinduló sejt klónjai) Többsejtű élőlények klónozása: I. Embrióosztási technika: Rutin módszer a jó tulajdonságokkal rendelkező háziállatok klónozására (pl. szarvasmarha). Mesterségesen egypetéjű ikreket állítanak elő. Lépések: 1. Egy petesejtet mesterségesen megtermékenyítenek spermiummmal. 2. A zigótát hagyják osztódni 8-sejtes embrióvá.

22 3. Az embriót 2 x 4-sejtes v. leggyakrabban 4 x 2- sejtes darabokra osztják. A sejtek még nem differenciálódnak a 8-sejtes embrióban  a szétválasztott embriók genetikailag azonosak, mint az egypetéjű ikrek : ikerkészítés embrióból. 4. A szétválasztott embriókat hagyják fejlődni in vitro. 5. Azután beültetik őket egy álterhes nőstény méhébe.

23 II. Testi sejtmag átvitele [somatic cell nuclear transfer (SCNT)] Ian Wilmut és Keith Campbell, Roslin Intézet, Skócia, 1997: a Dolly bárány létrehozása Az SCNT-hez két sejt szükséges: a magdonor testi sejt + egy megtermékenyítetlen petesejt mint recipiens sejt: - A petesejt megfelelőbb recipiens sejt, mint a testi sejtek: könnyebb osztódásra késztetni. - megtermékenyítetlen petesejt könnyebben befogadja a sejtmagot, mint a megtermékenyített. Az SCNT lépései (the Roslin-technika): 1. A donorsejtet (a Dolly esetében emlőmirigysejt) fötális borjúsavót tartalmazó tápfolyadékban tenyésztik, és hagyják osztódni in vitro.

24 2. Ezután a sejteket FCS-mentes tápfolyadékba helyezik  az osztódás leáll, és a sejtek G 0 v. nyugalmi állapotba kerülnek. Ez szükséges, hogy a recipens sejt befogadja a donormagot. 3. A sejtmagot eltávolítják a petesejtből. 4. A donorsejtet a mag nélküli recipens sejt közelébe helyezik órával a mageltávolítás után  elektromos inger: - donorsejt (v. izolált mag) fúziója a mag nélküli petesejttel; - a sejtosztódás aktivációja és az embrió fejlődése

25 A differenciált donorsejt genetikai programja lenullázódik a petesejtben  differenciálatlan, pluripotens sejt 6. Az embriót birka-petevezetékbe helyezik 5-6 napra (itt az embriók túlélése jobb, mint szövettenyészetben). 7. Amikor az embrió eléri a blasztoméra állapotot (kb. 100 sejt), az embriót beültetik egy dajka anya méhébe. 8. Az anya kihordja a terhességet. Az utódok a donor genetikailag pontos másolatai  reproduktív klónozás A blasztomérákat őssejtforrásként is lehet használni.

26 Honolulu-technika: egerek sikeres klónozása A klónozott állatok képesek voltak normálisan szaporodni, fenntartani a klónt szexuális reprodukció révén. Kromatintranszfer: A klónozandó sejtek kezelése eltávolítja a sejtdifferenciálódással kapcsolatos molekulákat, mielőtt a magot eltávolítják  a genetikai program lenullázódása könnyebben megy végbe.


Letölteni ppt "KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT, TRANSZGENIKUS ÉS GÉNKIÜTÖTT ÁLLATOK. KLÓNOZÁS Dr. Jánossy Tamás SZTE, ÁOK, Sebészeti Műtéttani Intézet."

Hasonló előadás


Google Hirdetések