Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

A tuberculosis mikrobiológiai diagnosztikája Corden/Korányi Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium Dr. Szabó Nóra Mediconsult továbbképző tanfolyam.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "A tuberculosis mikrobiológiai diagnosztikája Corden/Korányi Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium Dr. Szabó Nóra Mediconsult továbbképző tanfolyam."— Előadás másolata:

1 A tuberculosis mikrobiológiai diagnosztikája Corden/Korányi Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium Dr. Szabó Nóra Mediconsult továbbképző tanfolyam A légúti infekciók klinikuma és diagnosztikai kérdései 2013 szeptember 09.

2

3 Nemzeti Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium

4 Referencia Laboratórium működése Corden/Korányi 2009-ben felújított, korszerű, európai szintű 2009-ben felújított, korszerű, európai szintű BSL-2-3 szintnek megfelelő helyiségek a veszélyességi fokozatnak megfelelő munkafolyamatok szerint BSL-2-3 szintnek megfelelő helyiségek a veszélyességi fokozatnak megfelelő munkafolyamatok szerint Légtechnika, falhűtés, zsilip rendszer, negatív nyomás, lamináris bokszok, zárt rotorú centrifugák Légtechnika, falhűtés, zsilip rendszer, negatív nyomás, lamináris bokszok, zárt rotorú centrifugák Modern, korszerű technikai eszközök Modern, korszerű technikai eszközök A laboratórium jelenlegi diagnosztikai palettája, felszereltsége korszerű, nem marad el a fejlett európai országok ref. laboratóriumaitól (WHO : Mission report) GeneXpert NorDiag Arrow Wescor HAIN GeneXpert NorDiag Arrow Wescor HAIN

5

6 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS T Ö RT É NETE Koch Róbert: gümőbaktérium felfedezése, 1882 Nobel-díj, 1905 Ehrlich: saválló festés Franz Ziehl és Friedrich Neelsen: saválló festés továbbfejlesztése Koch Róbert

7 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TULAJDONS Á GAI Morfológiai sajátságok: 0,2-0,5µm átm. 1,0-5 µm hosszú, tokkal, spórával, csillóval nem rendelkező baktérium Morfológiai sajátságok: 0,2-0,5µm átm. 1,0-5 µm hosszú, tokkal, spórával, csillóval nem rendelkező baktérium Gram szerint nem festhető Gram szerint nem festhető Sav-és alkohol álló (carbolfuxin) Sav-és alkohol álló (carbolfuxin) Sejtfal lipidekben gazdag, hidrofób mycolsav tartalmú Sejtfal lipidekben gazdag, hidrofób mycolsav tartalmú Ellenálló: hónapokig életképes Ellenálló: hónapokig életképes Cord formáció: virulencia faktor Cord formáció: virulencia faktor

8 MYCOBACTERIUM NEMZETS É G (>150 species) Előfordulás: talaj, természetes vizek, hálózati meleg víz Pathogenitás: OBLIG Á T OPPORTUNISTASAPROPHYTA M. tuberculosis complex NTMNTM M. tuberculosis M. avium M. gordonae M. bovis, M.caprae M. simiae M. terrae M. bovis BCG M. xenopi M. triviale M. africanum M. srophulaceum M. phlei M. microti M. fortuitum M. vaccae M. canetti M. chelonae M. nonchromog. M. pinnipedii M. kansasii M. flavescens

9 Pathogenitás Species Rezervoár Betegség Pathogen M.tuberculosis ember, vadak, M.bovis, M.caprae szarvasmarha M.tub complex M.bovis BCG, vaddisznó, borz tbc M.africanum, M.microti M.canetti, M.pinnipedii fóka M.leprae M.leprae lepra Potenciálisan M.avium- talaj, madár, víz disszeminált-és pathogen M.intracellulare sertés, szarvasmarha tüdő inf. (AIDS) M.kansasii víz, szarvasmarha tüdő inf. M.marinum halak, víz bőrfekélyek M.ulcerans ember, környezet fekélyek M.abscessus- talaj, víz, állat tüdő, tályog, CF M.chelonae disszeminált

10 Fertőzés kialakulásának valószínűsége Inhaláció (1-5  m átmérő) cseppinfekció Nincs fertőzés 70-90% Fertőzés az alveoláris térben 10-30% Látens (nyirokrendszerben) 90% Acut TB (2 éven belül) 5-10% Megbetegedés Az élet során 10% Egy éven belül (HIV) 10% Infekció fellángolása -Endogén reaktiváció -Exogén reinfekció Egy beteg személy másikat képes megfertőzni egy év alatt.

11

12 WHO epidemiológiai adatok A világ népességének 1/3-a gümőbaktériummal fertőzött 8 millió új megbetegedés fordul elő évente 1,5 millió/év mortalitás, malária után a legmagasabb érték A fejlődő országokban (esetek 95 %-a) a felnőttek 20 %-a TBC-ben hal meg HIV/AIDS-ben a TBC a vezető halálok A WHO a tuberculosist húsz évvel ezelőtt világméretű fenyegetésnek nyilvánította

13 Global Tuberculosis Control. WHO Report WHO/CDS/TB/ high-burden countries totaling 80% of world cases Russia Cambodia China Philippines Vietnam Afghanistan Pakistan Ethiopia DR Congo Kenya Mozambique Nigeria S. Africa Tanzania Uganda Zimbabwe Bangladesh India Indonesia Myanmar Thailand Brazil

14 TB burden, EUR

15 Az európai TBC járvány változásának okai 1974 – 1990 között az incidencia 5,4 %/év csökkent Európában A trend megfordulásának okai: HIV pandémia HIV pandémia Immigráció növekedése Immigráció növekedése K-Európai országokban az Egészségügy szétrombolása K-Európai országokban az Egészségügy szétrombolása Szegénység miatt marginalizálódott populáció növekedése Szegénység miatt marginalizálódott populáció növekedése

16 Trend of TB incidence in Hungary Cases

17 A hazai tuberkulózis járványhelyzet Megbetegedések száma évről évre csökken: incidencia:1169 fő, 11 %ooo/ 2012 Megbetegedések száma évről évre csökken: incidencia:1169 fő, 11 %ooo/ 2012 (2010-ben már eliminációs szak) (2010-ben már eliminációs szak) Rezisztens izolátumok száma „magas” Rezisztens izolátumok száma „magas” MDR, XDR (hot spot) MDR, XDR (hot spot) Nő a NTM okozta mycobacteriosisok száma (5 év alatt megduplázódott) diagnosztika fejlődése Nő a NTM okozta mycobacteriosisok száma (5 év alatt megduplázódott) diagnosztika fejlődése

18 LABORAT Ó RIUMI KIMUTAT Á S 1. Direkt mikroszkópos: Ziehl-Neelsen Fluorochrome (auramin, rodamin) 2. Tenyésztés: Szilárd alapú Folyékony alapú 3. Identifikálás: hagyományos és mol. biol. módszerrel 4. Rezisztencia meghatározás: proporciós és mol. biol. módszerrel Molekuláris biológiai módszerek:  Direkt kimutatás: TMA, SDA, LCR, HAIN, GeneXpert, ProbeTec  Identifikálás: Reverz hibridizáció, DNS szekvenálás, MaldiTof  Rezisztencia meghatározás: LineProbe Assay-k:InnoLipa, HAIN  Genotipizálás: DNS fingerprint RFLP, Spoligotyping, VNTR-MIRU

19 1. Direkt mikroszk ó pos vizsg á lat Ziehl-Neelsen: carbolfuchs Kenet készíthető: direkt a mintából Auramin előkezelt minta üledékéből Rodamin fluorochrom cytocentrifugált mintából Előnye: gyors (fontos közegészségügyi szempont) olcsó egyszerű kevés eszköz igény relatíve specifikus (97 % M.TBC) egyéb savállók: atipusos Mycobakterium Rhodococcus Nocardia, Gordona, Tsukamurella, Legionella micdadei Hátránya: alacsony kimutathatósági határ ( CFU/ml)

20

21 Ziehl-Neelsen pozitív pálcák

22 Saválló pálcák

23 Auramin festés

24 Gold standard Előnye: specifikus érzékeny: bakt/ml ( %) identifikálni lehet rezisztencia végezhető genotipizálás, epidemiológiai kapcsolatok Hátránya: hosszú tenyésztési idő (6 - 8 hét) (generációs idő: óra) A molekuláris biológiai vizsgálatok mellett is kötelezően elvégzendő!!! 2. Teny é szt é s

25 Szilárd - tojás (L J, Ogawa, Stonebrink) - agar (7H10, 7H11) % szenz hét Folyékony - Bactec 12B, MGIT, MB Redox, ESP II, MB/BacT % szenz nap - több NTM, automatizált

26 M. tuberculosis L-J táptalajon

27 Hagyományos Növekedés sebessége Növekedés hőfoka Pigment termelés Biokémiai módszerek IDENTIFIKÁLÁS Molekuláris biológiai Accuprobe RFLP DNS sequenálás DNS chip LineProbe assay-k: HAIN, InnoLipa Maldi-Tof Obligát M.tbc compl. nem pigmentált cord képző niacin + nitrát + Opportunista, szaprofita, NTM pigment lehet cordot ritkán képez niacin – biokémiai próbák növekedés hőfoka és sebessége

28 Cord formáció

29 Mycobakterium kimutatása direkt a mintából Nukleinsav amplifikációs technikák (NAT) Specifikus nukleinsav szakasz amplifikálása - detektálása gyors érzékeny ? (határ: 10 bacillus) specifikus Fals poz.: szennyeződés (amplikonok) élettelen baktériumok is kimutathatók Fals neg.: minta mennyisége kevés DNS felszabadítása és lizise nem teljes a mintában a bakt. eloszlása inhomogén, összecsapzódhatnak Direktben poz. minta Direktben neg. minta szenzitivitás 95 % % specificitás 98 % 95 %

30 Molekuláris biológiai módszerek Csak légúti anyagokra vannak validálva a tesztek. Extrapulmonális anyagokkal, kezelés alatt álló betegek mintáival kevés a tapasztalat. Élő és élettelen bakt. kimutatható, ezért terápia monitorozására nem alkalmas NAT nem alkalmazható egymagában a M.TBC kimutatására, nem helyettesítheti a tenyésztést, és csak felkészült laboratóriumokban ajánlott az alkalmazásuk Gyorsaságuk miatt azonban differenciál diagnosztikailag problémás esetek kapcsán fontos és hasznos kiegészítő vizsgálatok.

31 MYCOBACTERIUMOK OKOZTA INFEKCIÓK DIAGNOSZTIKAI SÉMÁJA Pulmonális tbc gyanúja esetén legalább 3 egymást követő napon levett köpetminta bronchoscóppal vett minta, gyomormosó Extrapulmonális kórképek esetén megfelelő mennyiségű releváns vizsgálati anyag A minta előkezelése (koncentrálás, emésztés, dekontaminálás) NALC- NaOH, vagy más módszer Direkt kenet vizsgálata Ziehl-Neelsen, vagy fluorochrom festéssel TenyésztésMolekuláris biológiai m. (PCR,LCR,TMA, egyéb) Pozitív: előzetes lelet Negatív Eredményt össze kell vetni a tenyésztés és a kenet eredményével Szilárd táptalajon: L J, és vagy agar alapú Folyékony talajon (MGIT,BACTEC) Pozitív: identifikálás, rezisztencia meghatározás Negatív Pozitív: Kenet, tenyésztés L J táptalajon

32 Resistencia mechanizmusok 1.Csökkent sejtfal permeabilitás 2.Enzim termelés (ß-lactamase 3.Aktív pumpa rendszer 4.Génen kialakuló pontmutáció, deleció, inzerció: lépésről lépésre alakul ki, nem blockszerűen (Egyszerre többféle spontán módon létrejövő mutáció ritka, mivel egyszerre több génen kéne mutációnak kialakulni. MDR: halmozódó mutációk sorozata, amely nem spontán alakul ki, hanem emberi beavatkozás következménye Helytelen kezelés Nem megfelelő compliance

33 REZISZTENCIA VIZSG Á L Ó M Ó DSZEREI Hagyom á nyos Proporci ó s Molekul á ris DNS strip Kritikus koncentr á ci ó n á l az é rz é keny é s rezisztens t ö rzsek ar á nya Rezisztenci áé rt felelős g é neken t ö rt é nt mut á ci ó k, del é ci ó k é s inserci ó k detekt á l á sa Szil á rd alap ú : LJ, 7H10 Folyad é k alap ú : MGIT, Bact/Alert, Bactec460 Line probe assay-k GenoType MTBDR, GenoType MTBDR, MTBDR plus MTBDR plus InnoLipa Rif. InnoLipa Rif.

34 REZISZTENCIA MEGHAT Á ROZ Á S Minden újonnan izolált törzsből Ellenőrzésként legalább 4-6 havonta (CLSI) Minden rezisztens eredményt megerősíteni a)Proporciós visgálat/ rezisztencia arány/ Szilárd táptalajon 4-5 hét (biomassza!) Folyékony MGIT 4-5 nap b)Rezisztenciához társuló mutációk kimutatása – RMP (rpoB), – INH (katG, inhA) Direkt a mintából Izolált törzsből

35 RMP REZISZTENCIA É S MDR TUBERKUL Ó ZIS A RMP monorezisztencia ritka, a RMP rezisztencia az esetek 70%- ban INH rezisztenciával párosul (= MDR TB) A RMP monorezisztencia ritka, a RMP rezisztencia az esetek 70%- ban INH rezisztenciával párosul (= MDR TB) A RMP rezisztencia közel 100%-ban az RNS polimeráz b alegységét kódoló rpoB gén egy igen rövid (81 bp) szakaszán található mutációkkal párosul (Telenti et al., 1993) A RMP rezisztencia közel 100%-ban az RNS polimeráz b alegységét kódoló rpoB gén egy igen rövid (81 bp) szakaszán található mutációkkal párosul (Telenti et al., 1993) Így a RMP rezisztenciát okozó mutációk gyors molekuláris detektálása a MDR TB felismeresét is jelentősen meggyorsítja és megkönnyíti Így a RMP rezisztenciát okozó mutációk gyors molekuláris detektálása a MDR TB felismeresét is jelentősen meggyorsítja és megkönnyíti

36 GenoType Mycobacteria HAIN MDR kimutatható MDR kimutatható Rifampicin rezisztencia rpoB génmutáció Rifampicin rezisztencia rpoB génmutáció INH rezisztencia magas fokú: katG gén INH rezisztencia magas fokú: katG gén alacsony fokú: inhA gén alacsony fokú: inhA gén Izolált törzsből Izolált törzsből Saválló pozitív beteg mintájából közvetlenül Saválló pozitív beteg mintájából közvetlenül

37 1)DNA Extraction 2) Amplification by PCR 3) Hybridization Reverse hybridization of amplified nucleic acids to specific DNA probes bound on strips 4) Evaluation 2008 : WHO recommendations for the use of molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of MDR-TB

38 Reaction zones of GenoType ® MTBDRplus (examples)

39 GeneXpert:Cepheid folyamat ábra ( zárt rendszerű automata) minta Puffer hozzáadása manuálisan Nucleinsav extrakciója, lysise Nucleinsav tisztítása, koncentrálása Reakciócsőben végbemenő amplifikáció, detektálás Molekulák összehozása az amplifikációs és detektáló reagenssel Eldobható Cartridge Eldobható Cartridge

40 PAGE | 40 Xpert MTB/RIF alkalmazási területe Xpert MTB/RIF alkalmazási területe Az assay (Cepheid GeneXpert System) semi-quantitative in-vitro diagnosztikus teszt Az assay (Cepheid GeneXpert System) semi-quantitative in-vitro diagnosztikus teszt Az Xpert MTB/RIF Assay a Mycobacterium tuberculosis complex és a rifampicin rezisztencia gyors detektálására szolgáló vizsgálat. Tuberkulózis klinikai gyanúja esetén felnőttek köpet mintájából ajánlják a teszt végzését. Az Xpert MTB/RIF Assay a Mycobacterium tuberculosis complex és a rifampicin rezisztencia gyors detektálására szolgáló vizsgálat. Tuberkulózis klinikai gyanúja esetén felnőttek köpet mintájából ajánlják a teszt végzését. Mind a direkt kenetben pozitív (sens: %), mind a direkt negatív (sens:72-91 %) esetekben javasolt a vizsgálat. Mind a direkt kenetben pozitív (sens: %), mind a direkt negatív (sens:72-91 %) esetekben javasolt a vizsgálat. The Xpert MTB/RIF assay a kezelés monitorozására nem alkalmas The Xpert MTB/RIF assay a kezelés monitorozására nem alkalmas Gyors, egyszerűen kivitelezhető, magas szenzitivitás a direkt neg. mintáknál, zárt rendszer, kereszt kontaminációra nem érzékeny, nem igényel különleges biológiai biztonsági feltételeket. Gyors, egyszerűen kivitelezhető, magas szenzitivitás a direkt neg. mintáknál, zárt rendszer, kereszt kontaminációra nem érzékeny, nem igényel különleges biológiai biztonsági feltételeket. Drága? Drága? * Sept Boehme et colleagueswww.nejm.org

41 Xpert MTB/RIF alkalmazása extrapulmonális mintáknál A teszt légúti mintákra van validálva Újabb vizsgálatok szerint extrapulmonális minták esetében (biopsia, genny, liquor stb) is jó a Újabb vizsgálatok szerint extrapulmonális minták esetében (biopsia, genny, liquor stb) is jó a senzitivitása: 81 % és senzitivitása: 81 % és specificitása: 99,6 % specificitása: 99,6 % Vadwai W et al.: J.Clin.Microbiol July Vadwai W et al.: J.Clin.Microbiol July Ugyancsak kitűnő érzékenységet mutatott a teszt a tenyésztéshez viszonyítva vizelet 100 % Ugyancsak kitűnő érzékenységet mutatott a teszt a tenyésztéshez viszonyítva vizelet 100 % széklet 100 % esetében széklet 100 % esetében Hillemann D. et al..: J.Clin.Microbiol Apr Hillemann D. et al..: J.Clin.Microbiol Apr

42 Gyors diagnosztikai molekuláris módszerek rutinszerű alkalmazása Direkt kimutatás: M.tuberculosis complex Direkt kimutatás: M.tuberculosis complex ProbeTec ProbeTec GenoType MTBDRplus (HAIN): RMP és INH rezisztencia egyidejű meghat. GenoType MTBDRplus (HAIN): RMP és INH rezisztencia egyidejű meghat. légúti mintából, kezeletlen beteg mintájából légúti mintából, kezeletlen beteg mintájából GeneXpert-Rif: RMP rezisztencia egyidejű meghatározása GeneXpert-Rif: RMP rezisztencia egyidejű meghatározása Identifikálás: M.tub.compl elkülönítése, gyakori és ritka NTM azonosítása Identifikálás: M.tub.compl elkülönítése, gyakori és ritka NTM azonosítása GenoType MTBC GenoType MTBC GenoType/CM, AS GenoType/CM, AS Rezisztencia vizsgálat I. és II. rendű szerek iránt Rezisztencia vizsgálat I. és II. rendű szerek iránt GenoType MTBDR (HAIN) GenoType MTBDR (HAIN) GenoType MTBDRsl GenoType MTBDRsl GeneXpert-Rif GeneXpert-Rif Vizsgálat ideje: 1-7 nap vs nap

43 Izolátumok hagyományos és molekuláris vizsgálatának leletátfordulás ideje időidő M.tbc.compl.ident.1-2hónap HAIN MTBC M.tub.compl.ident M.bovis. M.BCG id. 2-3 nap M.tbc compl. id.és INH+RMP rez hónap HAIN MTBDR plus 2-3 nap M.tbc compl. id.és II.r.szerek+ETB rez 2-4hónap HAIN MTBDrsl 2-3 nap Gyakori atypusos NTM identifikálása 2-5hónap HAIN CM 2-3 nap Ritka atypusos NTM identifikálása 2-5hónap HAIN AS 2-3 nap Hagyományos módszer Molekuláris módszer

44 Köszönöm a megtisztelő figyelmüket!


Letölteni ppt "A tuberculosis mikrobiológiai diagnosztikája Corden/Korányi Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium Dr. Szabó Nóra Mediconsult továbbképző tanfolyam."

Hasonló előadás


Google Hirdetések