Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus TEM és FM, símaizomsejt thrombospondin tartalom ER-ben Bombix mori.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus TEM és FM, símaizomsejt thrombospondin tartalom ER-ben Bombix mori."— Előadás másolata:

1 Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus TEM és FM, símaizomsejt thrombospondin tartalom ER-ben Bombix mori csáp km. a: konvencionális b: kriofixálás c: freeze-substitution

2 STEM – EELS anyagszerkezeti alkalmazás

3 Növényi elektronmikroszkópos technikák 1. Áttekintés 1.1. Az EM munka célja 1.2. Feltételei 1.3. Lehetőségei 1.4. Korlátai Felbontás - mélységélesség Felhasználhatóság - alkalmazhatóság Hibái – műtermékek Költség, idő 1.5 Az EM, mint módszer értékelése

4 2. Konvencionális minta-előkészítés TEM-re 2.1 Főbb lépések:mintavétel FM fixálás víztelenítés átitatás beágyazás – minta blokkban késgrid ultramikrotóm (hártya) metszés FM festés TEMVIZSGÁLAT EREDMÉNY „processing”

5 1947, in vitro tenyésztett sejt széli régiója patkány mirigyes szövet A:1956 B:1962 – minőségi változás jelentős

6 2.2 Történetiség Műszaki fejlődés Tudományos fejlődés 3. Mintavétel 3.1 A minta kiválasztása 3.2 Mintaszám 3.3 Minták kezelése Manuális munka Dokumentálás – fixálási napló 4. Fixálás: life-like state/változás minimalizálása/ Fixálás jó: minta olyan, mint FM-ben /félvékony metszeten/ ha strukturális sérülés nincs ha térfogatváltozás nincs ha különböző fixálókkal is u.a. az eredmény

7 Fixáló: + stabilizálja az „élő” struktúrát - attól (jelentősen) eltérő struktúrát eredményez rossz fixálás:fiziológiás elváltozás strukturális elváltozás apróbb (strukturális, térfogati) változás jó fixálás:nincs látható elváltozás 4.1 Fixáló oldat:a. fixáló ágensb. hordozó közeg Fixálási környezet:pH ozmolaritás ion koncentráció és összetétel

8 Fixálók:teroxidok /OsO 4, RuO 4, ruthenium hexammine trichloride/ aldehidek /GA, FA, akrolein, stb./ KMnO 4 /és más permanganátok/ uranil acetát „Hordozó” közeg: követelmények:állandó pH fixálás során ozmolaritás ionösszetétel ne legyen toxikus, büdös pufferek + ozmotikumok + ionok foszfát puffer /Sörensen f./jó kakodilát pufferAs (toxikus) veronál acetát pufferbarbiturál (toxikus) és büdös kollidin büdös (piridin) szerves pufferekjók, de drágábbak

9 pH:6.8 – 7.5 (8)OsO 4 – pH: 6.0 uranil acetát – pH: Ozmolaritás:minta saját ozmolaritása (optimális) fixáló penetrációja membrán permeábilitás változás fixáláskor fixáló ozmotikumként viselkedik-e kissé hipertóniás jobb, mint hipotóniás beállítás: puffer koncentráció (itt nem a fixálóé!) fixáló koncentráció ozmotikum (NaCl, glukóz, szacharóz, mannitol) gl., szach. OsO 4 -nál nem, aldehideknél jó Ionösszetétel: monovalensjó (NaCl) bivalensmembránokra jó, De: precipitáció, fiziológiás elváltozás (Ca, Mg, bikarbonát) lehet!

10 Amőba sejt részlete A: konvencionális, enyhén hiperozmotikus környezet B: freeze-substitution Apró különbségek: plazmamembrán és vakuolumok membránjainak „kifeszült” megjelenése

11 4.2 Pufferek: Foszfát puffer: + fiziológiás bivalens ionok nem toxikus pH nem változik a hőmérséklettel, stabil - precipitáció lehet mikroorganizmusok szeretik lassú penetrációjú és reaktív fixálókhoz is Sörensen félemono- és dibázikusNa-foszfát Na-K-foszfát Kakodilát puffer:+ stabil nincs csapadék - rossz szagú toxikus aldehidekkel (első fix.) foszfát pufferhez hasonló eredmény

12 4.2.3 Veronál acetát puffer: + nincs csapadék /2. és 3. fix./ - csak néhány szövetre jó (OsO 4 -el) nem tárolható (mikroorganizmusok) aldehidekkel reagál (puffer kapac.) Kollidin:  -(s)-kollidin (2.4.6-trimetil piridin) Nem ajánlható, csak speciális esetben!! + pH:7.4-nél igen jó puffer kapacitás szobahőn is stabil jól penetrál – nagy blokkok fixálása - extrakció - OsO 4 /nagy blokk és 2. fix. -jobb/ membránsérülések toxikus és büdös

13 4.2.5 PIPES puffer: piperazin-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) 0.3 M ozmolaritást ellenőrizni /2x-3x hígítani/ pH között 0.1 M NaOH HEPES puffer: N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid 0.2 M pH között -0.2 M NaOH MOPS puffer: 3-(N-morpholino)propane-sulfonic acid 0.2 M pH között-0.2 M NaOH

14 A FA+foszfát puffer – jó struktura B FA+kakodilát puffer – jó struktura C FA+kollidin – erős kimosódás, membránsérülések Neutrofil granulocita

15 4.3 Fixálók: 4.3.1Tetroxidok OsO 4 : 1927 Strangeway and Canti – FM fixálók sötétlátóteres mikroszkópia - „jobb felbontás” EM – első ultravékony metszetek lassú penetrálás – kicsi minta /0.5-1 mm átmérő/ /puffer meggyorsíthatja – ion és membrán kölcsönhatás/ főként lipideket (foszfolipid) fixál /ezeket aldehidek nem!/ festés is egyben membrán permeábilis lesz – minta ozmolaritása változik /puffer kevésbé fontos 2. fix.-nál/

16 Os 4 fixálásra elváltozás: mielin – zsugorodás izolált sejtek – enyhe duzzadás (NaCl) Ca – jó /1-3 mM, ha több: precipitáció) Mg – jobb?? csersav hozzáadása: jobb fixálás, jobb nehézfém ion kötés Forgalmazás:kristályos ill. oldott - ampulla Tárolás Előkészítés: törzsoldatoldás – 24 óra!!! szonikálás – rövidebb idő használat:elszívófülke!!! /erősen párolog/ hulladék kezelése műanyagon át is penetrál

17 használat:elszívófülke!!! /erősen párolog, nyálkahártya irritáló/ erős oxidálószer – mindent feketére színez hulladék kezelése műanyagon át is penetrál alkalmazhatóság: foszfát puffer + OsO 4 – jó (de csersavval nem) kakodilát puffer + OsO 4 – inkább 2. fix., (csersavval is) veronál a. puffer + OsO 4 – nem ajánlott (2. fixálás) kollidin + OsO 4 –nem ajánlott (2. fixálás) ma: GA után, mint 2. fixáló

18 Ruténium tetroxid (RuO 4 ) fixálás-festés 1887-től napjainkban részben hisztokémia, részben fixáló fixáláskor történő alkalmazása ritka + poliszacharidokkal is reagál finomszemcsés festődés – jobb feloldás - nehezen penetrál, külső sejteket fixálja csak gomba sejtfalon (intakt) is nehezen jut át protoplasztok, izolált sejtek, kis minták (  1 mm 3 ) jó szobahőmérsékleten fixálás (4 o C nem ajánlott) erőteljes oxidálószer, bomlékony (friss: aranysárga) egészségre káros - elszívófülke

19 forgalmazás:kristályos 0.5 % oldat – ampullában fixálás (egyben festés): % RuO 4 oldat

20 RHT – Ruthenium hexammine trichloride Mw: inkább festék, de OsO 4 után alkalmazzák nagy töltéssűrűség (3 + ), kis molekulasúly, nincs aggregáció OsO 4 után RHT (kakodilát puffer) – nem kell utólagos festés finomszemcsés festődés – jobb feloldás GA-val stabilizáló – proteoglikánok, szénhidrátok, (kakodilát p.)extracelluláris mátrix % GA + 1% OsO % RHT pH: 7.4 fixálás: szoba hőmérsékleten (4 o C nem ajánlott) oldatot használat előtt 1 órával csinálni!!! /bomlás/ foszfát puffer és kollidin nem optimális hozzá forgalmazás: aranysárga por, stabil forma éveken át

21 O Aldehidek: – C H O glutáraldehid C – CH 2 – CH 2 – CH 2 – C H O formaldehid H – C H O paraformaldehid C – O– CH 2 (– O CH 2 ) n – O – C H CH2 akrolein CH O C H (glioxál, krotonaldehid, acetaldehid, metakrolein) foszfát és kakodilát pufferben jó fixálók (esetleg kollidin)

22 Glutáraldehid (GA): önállóan nem jó igazán /OsO 4 sem!/ napjainkban: GA + OsO 4 illetve (FA+GA) + OsO 4 + dialdehid – keresztkötés – tárolható minta fehérjékkel reagál – OsO 4 mellett fehérje extrakció kisebb /glikogénnel reagál – OsO 4 erősebben festi/ - lipidekkel nem reagál /akár 95% veszteség, OsO 4 ezt csökkenti/ nem változtatja meg az ozmotikus viszonyokat a mintában belépéskor, így a puffer ozmolaritása meghatározó Tehát GA jó fixáló, de OsO 4 utófixálás elengedhetetlen

23 GA minősége: monomer – polimer aránytól függ /280 nm/ /235/ nm tisztítás: desztillálás o C (olaj 154 o C) aktívszenes mosás – szűrés tárolás: hőmérséklet igen fontos (+4, vagy -20 o C) forgalmazás:ampullázott (25, 50%) „nyers” oldat (elvileg 25%) pH: 6.8 – 7.5 (7.5 felett GA polimerizálódik) használat: 2 - 4% első fixálóként (0.05% előfixálásnál) Ca használata nem zavaró pufferek: foszfát puffer – jó kakodilát puffer – jó veronál acetát puffer – nem használható kollidin – nem ajánlott szerves pufferek – jók

24 Formaldehid (FA): eleinte rossz volt (11-16% metanol!) paraformaldehidből frissen – jó fixáló + jól penetrál (nagyobb blokkok, precipitáció kisebb) foszfát puffer kissé lemarad fehérjékkel reagál – de monoaldehid! lipidekkel is reagál (korlátozottan) - fixálás után a minta pufferben nem tartható el hosszan lipidekre utófixálás kell FA nem ozmotikum – puffer ozmolaritása meghatározó (membrán szemipermeabilitás részben megmarad) FA jó fixáló, jól penetrál, de OsO 4 utófixálás kell, Ca jó

25 FA felhasználás: foszfát puffer – jó, ha lehet, ezt használni – 4% FA kakodilát puffer – jó, Ca kell, hűtőben stabil – 4% FA veronál acetát puffer – kerülni kollidin – 10% FA nagy blokk, jobb behatolás, de extraktív, ezért csak indokolt esetben GA + FA keverék jobb hatásfokú első fixáláshoz FA gyors penetráció, reaktívabb GA keresztkötések, stabilizál 4% FA + 2% GA % CaCl –0.1 M kakodilát /foszfát/ puffer

26 Akrolein: nagy/tömött/növényi minták + leggyorsabban penetráló aldehid fixáló /0.5-1%/ - toxikus lipidoldó hatás enzimaktivitást gátló mikrotubulusok szétesnek Akrolein+GA – FA+GA alternatív /OsO 4 utófixálás kell/ 1% akrolein + 2-4% GA (0.1 M foszfát puffer, pH 7.2) ozmolaritás, CaCl 2 vagy MgCl mM Akrolein+GA+FA igen tömör, növényi anyagokhoz

27 4.3.3 Permanganátok: KMnO 4 /Na-, Zn-, Ba-, La-permanganát/ régebben gyakori volt, ma botanikai, mikológiai, membránvizsgálatoknál kivételesen - extraktív hatás (GA+ OsO 4 fixálás hasonlítás) fehérje, lipid (membránt is károsítja) RNA (DNA megőrződik, bár rosszul) duzzadás, morfológiai deformáció – 0.5% NaCl 0.5-1% KMnO 4 /K 2 Cr 2 O 7 + OsO 4 jobb, de nem jelentősen/

28 4.3.4 Keverék fixálók: pl. GA + OsO 4 együtt más hatás, mint egymás után – reagálnak más állapotúak (?) kompetició az aminosavakért (?) frissen készíteni 2.5% GA+1% OsO 4 0.1M kakodilát pufferben (pH:7.2), utófixálás uranil acetátban 0 o C max. 1 óra Speciális fixálók: inkább csak adalékként szerepelnek uranil acetát: membrán stabilizáló (?) enyhe extrakció /pl.glikogénre/ % víz, veronál acetát puffer pH:5.0 !! /foszfát és kakodilát nem, kiválások!/ ferricianid, digitonin, trinitro-komponensek (pikrinsav származékok)

29 4.4 Fixálás módja:általános recept nincs! irodalmi receptek hasonlót adaptálni - módosítani általános szempontok: gyorsan (degradáció megelőzése)immerziós in situ perfúziós kicsi minta (penetráció), ha nagy minta – nagy penetrációjú fixáló és puffer (FA, akrolein, kollidin) keverés kicsi edények (anyag, pénz) idő /mintafüggő/ - hosszú: műtermék képződés hőmérséklet /pl. mikrotubulusok alacsony hőn rosszul/ mikrohullámú sugárzás diffúzió /hő!/rotáció reakció ráta

30 mosás: aldehid – OsO 4 között fontos óra /éjszaka/ - tárolás mosás a „hordozóval” /bár ozmolaritás itt már nem olyan fontos/ növényi minták: vízvesztést kerülni, kicsi minta, kettős fixálás, vákuum – szőrök közötti, intercelluláris térben levegő gombák: mint növények, celofán módszer monolayer kultúrák: petri csészében,tárgy-, vagy fedőlemezen (teflon spray) izolált sejtek, sejtorganellumok: centrifugálás, szűrés, agar,alginát, fehérje baktériumok: agar, alginát, fehérje tengeri élőlények: GA és OsO 4 tengervízben oldva

31 5. Dehidratáció:(min. minta V 10x)etanol aceton hasonló hatás, de aceton erősebben higroszkópos, így dehidrálás tökéletlen lehet (abs. aceton lépésnél) gyanta minősége döntő: vízoldékony – nem kell polieszter – aceton etanol, végén aceton etanol, végén sztirén epoxi – aceton etanol, végén propilénoxid

32 5.1 Kémiai hatás dehidratálás: minta – oldószer Lipid kioldás: akár 95% (főleg 70% felett, ill. PO) mértéke redukálhatóOsO 4 fixálás uranil acetát fixálás aceton használata alacsony hőmérséklet gyors munka Fehérje kioldás:kb. 4% (főleg (70% alatt, 95% - PO nincs) mértéke redukálhatóGA fixálás gyors munka Lipid és fehérje kioldás miatt zsugorodás – minimalizálni dehidratáció gyenge hatású artefakt képző, fixálókhoz hasonló nem kritikus lépése a munkának Lehet 0 o C-on, 4 o C-on, szobahőn – nincs igazán nagy jelentősége

33 5.2 Általános menete: (15), 25, 50, 70, 90, 96(95), 100% etanol, v. aceton intermedier folyadék (pl. etanol után PO) – párolgás, tűzveszélyes perc az egyes lépésekre (kompakt anyag, növényi minta, nagy blokk 20 perc) idő csökkenthető: minták mozgatása, közeg keverése szobahőmérsékleten 4 vagy 0 o C helyett oldatok cseréje kisebb blokkok (infiltráció is gyorsabb!) tárolás – éjszakára 70% etanolban (hűtőszekrényben) szupergyors víztelenítés: a fentieket maximálisan kihasználva így kb. 2 percre is csökkenhet a dehidratáció + 1 perc absz. etanol + 2 perc PO (3x csere!)

34 5.3 Részleges dehidratálás: pl. EPON 812 oldható 70% etanolban menete:30% (15’), 70% (30’), 70% (30’) 1:1 70% etanol és EPON 812 keverék (30’) beágyazó EPON 812 szobahőmérsékleten (60’) beágyazó EPON o C (30’) polimerizáció

35 5.4 Etilén glikol: fixálás nélküli víztelenítés nem okoz jelentős konformáció változást (immunológiai, citokémiai alkalmazás) PEG 200 is használható menete:5 ml 10% etilén glikol 50% fölé növelni 5 perc alatt (cseppenként 7 ml etilén glikol hozzáadás, rázatás, szövet átlátszó lesz) további víztelenítés (2-3 perc tiszta e.g.-ban) a minta 4 o C-on eltartható tiszta etilén glikolban, abból közvetlenül átvihető: hidroxipropil metakrilátba epoxi gyantába poliészter gyantába nem! lipid vesztés van! (70% e.g.-ban GA és OsO 4 véd) zsugorodás és destrukció van

36 5.5 Intermedier folyadék: etanol, propilén oxid szerepe: intermedier dehidratáló infiltráció közege I. infiltráció: cc. PO + gyanta (1:1) (fokozatosabb átmenet 2:1, 1:1, 2:1) II. infiltráció dehidratálás közben: 20 és 40% PO vízben 70% vizes PO + EPON 812 (1:1) 90% vizes PO + EPON 812 (1:1) 100% PO + EPON 812 (1:1) tiszta EPON 812


Letölteni ppt "Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus TEM és FM, símaizomsejt thrombospondin tartalom ER-ben Bombix mori."

Hasonló előadás


Google Hirdetések