Immunbiológiai laboratóriumi vizsgálati módszerek Indikációk 1., Fertőző betegségek, vakcinálás eredményének ellelnőrzése, transzplantációt megelőzően.

Az előadások a következő témára: "Immunbiológiai laboratóriumi vizsgálati módszerek Indikációk 1., Fertőző betegségek, vakcinálás eredményének ellelnőrzése, transzplantációt megelőzően."— Előadás másolata:

1 Immunbiológiai laboratóriumi vizsgálati módszerek Indikációk 1., Fertőző betegségek, vakcinálás eredményének ellelnőrzése, transzplantációt megelőzően  egészséges immunrendszer 2., Immunrendszert érintő betegségek esetén  Immundeficiencia  Autoimmunitás

2 Immundeficienciák

3

4 Betegségek és állapotok, melyekben immundefektus észlelhető

5 Autoimmun betegségek

6

7

8

9 A vizsgálatok felhasználás területe szerinti osztályzása Fertőző betegségek diagnosztikája Immunglobulinok és autoantitestek vizsgálata Fagocitasejtek funkcionális vizsgálata Celluláris immunitás vizsgálata Allergiológiai vizsgálatok A hisztokompatibilitási rendszer vizsgálata

10 A fertőző betegségek diagnosztikája Szerológiai vizsgálatok Nukleinsav analítis (PCR, RT-PCR, hibridizációs technikák, stb.) (a részletei a gyakorlatok anyagát képezik)

11 A szerológiai módszerek elve Térhálós szerkezet Nincs térhálós szerkezet  jelzőrendszert alkalmazunk fizikai biológiai Agglutináció RIA vírusneutralizáció Hemagglutináció ELISA Treponéma immob. Coombs-teszt IFA komplementkötés Precipitáció blot-módszer

12 Immunglobulinok és autoantitestek vizsgálata Immunglobulinok  antigén-specificitástól független!! Minőségi, mennyiségi meghatározás főleg szerológiai módszerekkel Vizsgálati anyag: szérum, vizelet (normál patológiás) Autoantitestek  specifikus, autoantigének ellen termelt !! Természetes autoimmunitás (CD5+, B1 sejtek)--- immunológiai „homunculus” Patológiás autoimmunitás (effektorok: antitestek,imm.kompl.,autoreaktiv T sejt) Multifaktoros (genetikai tényezők, ferőzések) Szisztémás, vagy szervspecifikus effektorok Fő ismert autoantitestek (> 100 !) Szerológi módszerek ( l.: gyakorlat anyaga)

13 A komplementrendszer vizsgálata A komplement szerepe Mit eredményezhet a komplement defektusa A fertőzések fokozott incidenciája Autoimmun betegség Regulációs zavarok (pl.: fokozott aktivitás  szövetkárosodá, gyulladás) Indikációi: rekurrens fertőzések autoimmun kórképek HUS örökletes angiooedema (HANO)

14

15 Módszerek: Összkomplement meghatározás (CH 50 /ml) Komplement-fehérjék meghatározása RT-PCR, ELISA In vitro komplementációs teszt ( a komplement nem species-specifikus) A komplementet használják még: Komplementkötési reakciókban Az egyik HLA-tipizálási tesztben  komplement függő mikrotoxicitási teszt PBMC(vizsg.) + allélspecifikus EA + komplement---  lízis

16 CH50 meghatározás (titrálás: savóhígitásokat használnak)

17 A komplement rendszer elemeivel szemben képződő autoantitestek és az okozott kórképek

18 Fagocita sejtek funkcionális vizsgálata Szerepük defektus A defektus lehet: elsődleges-------másodlagos megnyilvánulhat: Migráció csökkenésben (<kemotaktikus faktorok,<kemokin receptor) Partikulum felvétel ( <FcR, <CR) Intracelluláris ölés (W.-A. betegség, CGD, stb) Degranuláció (C.-H. betegség)Módszerek: Migráció vizsg. (membrán alkalmazása) Partikulum felvétel (rádioaktív partikulumok) Intracelluláris ölés (direkt  élőcsiraszám meghat.; indirekt  reaktiv intermed.)

19 Celluláris immunitás vizsgálata A celluláris immunitás szabályzása rendkívül összetett ezért az Immunkompetencia vizsgálata az elsődleges célkitűzés Az immunkompetencia vizsgálatának indikációi Bizonyos fertőzés-tipusok (rekurrens, terápiára rezisztens, opportunista) Immundeficienciák, autoimmun betegségek diagnosztikája Szervátültetést követően az immunológiai rekonstitució nyomon követése Immunszuppressziv onkoterápiás eljárások követése Mesterséges immunizálás eredményének ellenőrzése Stb. Néhány nehézség Vizsgálat tipusa (minőségi, mennyiségi) A vizsgálat fajlagossága (az eredmény közvetlenűl utal-e a betegségre) Referencia tartományok („normál értékek”) Anyagi,technikai,szakmai lehetőségek

20 A celluláris immunitás vizsgálatának módszerei In vivo Bőrpróbák GM állatok (knock out, transgén egerek) In vitro Sejtanalitikai módszerek (morfológia, felszini markerek, áramlási citometria) Funkcionális vizsgálatok Poliklonális és specifikus aktiválás Proliferációs vizsg. T,B, DC funkcióképessége Effektor molekulák (pl. citokinek,kemokinek, stb.) Stb.

21 Felszini markerek vizsgálata CD rendszer (cluster of ifferentiation) Jellemző: Populációra Szubpopulációra Differenciáltságra Sejtek állapotára Módszer: Áramlási citometria (flow cytometry) In vitro vizsgálati módszerek

22

23

24 Az immunsejtek aktiválhatóságának vizsgálata Mitogénekkel indukált T-sejt blaszt-transzformáció (aspecifikus !) Blasztok morfológiai megfigyelése Timidin inkorporáció MTT-teszt CFSE (l.: áramlási citometria) Antigénekkel indukált T-sejt aktiválás (specifikus !) Módszerek: mint fent Kevert limfocita kultúra MHC kompatibilitás (transzplantáció) Limfokin termelés képességének vizsgálata Extracelluláris : ELISA, ELISPOT, biológiai titrálás Intracelluláris : l.: áramlási citometria

25 Az ELISPOT technika

26 A citotoxikus sejtfunkciók vizsgálata CTL sejtfunkció: Az MHC-I által prezentált antigén felismerése A célsejt elpusztítása Antigén lehet: Allogén (HLA-A, B, C) Autológ (vírusfertőzött, v. tumoros sejt) A folyamat sémája: Stimulálás Aktiváció/proliferáció Célsejt lízise (apoptozis

27 Módszerek a citotoxikus hatás kimutatására: 51Cr-release technika Apoptózis detektálása Egyéb módszerek - Antigénfelismerés tetramer komplex technikával -CTL aktiválódás detektálása (intracelluláris GIFN : l.: áramlási citometria) Egyéb citotoxikus reakciók: NK ADCC

28 Áramlási citometria (flow cytometry) Multifunkcionális eszköz egyedi sejtek elemzésére ( sejtpopulációk statisztikai kiértékelése, multiparaméteres vizsgálat)

29 Áramlási citometriával elemezhető: Sejtméret Granuláltság Extra- és intracelluláris markerek jelenléte (fluoreszcens ellenanygokkal) DNS tartalom/sejtciklus vizsgálat Példák az alkalmazásra: Perifériás leukociták vizsgálata: Differenciálás fényszórás alapján Markervizsgálatok Sejtpopulációk Sejtérettség Kóros fenotipusok Aktivációs markerek Proliferáció (CFSE)

30

31

32

33

34

35 Sejtproliferáció vizsgálata áramlási citometriával

36 Effektor sejt azonosítás (intracelluláris GIFN kimutatás)

37 Antigén-specifikus T-sejtek meghatározása „tetramer-stining” módszerével