Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Szerkezetvizsgálati módszerek a biofizikában 2016 tavaszi félév Czirók András, Szabó Bálint Elérhetőség: 3.146-os szoba,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Szerkezetvizsgálati módszerek a biofizikában 2016 tavaszi félév Czirók András, Szabó Bálint Elérhetőség: 3.146-os szoba,"— Előadás másolata:

1 Szerkezetvizsgálati módszerek a biofizikában 2016 tavaszi félév Czirók András, Szabó Bálint Elérhetőség: os szoba,

2 Félévi tematika I. (Szabó Bálint) 1.Optikai spektroszkópia. Kétsugaras abszorpciós spektrofotométer, fluoreszcens spektroszkópia, ultragyors lézerspektroszkópia, cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia, Förster típusú energiatranszfer (FRET) spektroszkópia. 2.Membránvizsgálati technikák és elektorfiziológia. Langmuir-Blodgett (LB), black lipid membrane (BLM) és patch-clamp. 3.Mikrofluidika. Az ún. lab-on-a-chip koncepció alkalmazása a biológiában. Alapvető fizikai határok és technikai problémák: felületi erők, lamináris áramlás, adszorpció. Kétfázisú, nagy áteresztőképességű csepp alapú mikrofluidikák. 4.Optikai mikroszkópok I. Konjugált síkok a modern mikroszkópokban. Inverz, fáziskontraszt, epifluoreszcens mikroszkópok. Fluoreszcens fehérjék és optogenetika. 5.Optikai mikroszkópok II. Konfokális és két-foton mikroszkópok. A pont szétterülési függvény (point spread function: PSF), diffrakciós limit és szuperfelbontású technikák. Teljes visszaverődésen alapuló TIRF mikroszkóp. 6.Pásztázószondás módszerek. Atomi erőmikroszkóp (AFM): felépítés, üzemmódok, vizsgálható struktúrák és jelenségek.

3 Félévi tematika II. (Czirók András) Röntgen krisztallográfia. Tömegspektrometria. NMR spektroszkópia. Szeparációs technikák I. Szeparációs technikák II. Molekuladinamika.

4 Vizsga 1.A félév végén, de még a szorgalmi időszakban tartunk egy ZH-t. Ennek alapján megajánlott jegyeket lehet szerezni. 2.Vizsgaidőszakban beadandó feladatok ill. szóbeli vizsga.

5 Irodalom a felkészüléshez Damjanovich et al.: Orvosi biofizika tankönyv

6 I. előadás: Optikai spektroszkópia 1.Kétsugaras abszorpciós spektrofotométer 2.Fluoreszcens spektroszkópia 3.Förster típusú energiatranszfer (FRET) spektroszkópia 4.Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia 5.Optikai hullámvezető spektroszkópia 6.Raman spektroszkópia

7 Abszorpciós spektroszkópia Miért érdemes abszorpciót mérni? Beer-Lambert törvény: I = I ε(λ)cl, a = ε(λ)cl Fehérjék 280 nm ill. 200 nm körül nyelik el az UV fényt. Az abszorpciót az aromás aminosavmaradékok: tirozin, triptofán, fenilalanin ill. a peptid kötések okozzák. Felhasználási területek: fehérje koncentrációjának mérése 280 nm-en.

8 DNS UV abszorpciója A DNS-nek 260 nm-nél van abszorpciós csúcsa, ami a 4-féle bázis spektrumából adódik. A távoli UV-ban erősen elnyel a DNS. UV fénnyel lehet sterilizálni, a bőrrák oka is hasonló (UV B). Kettős szálú DNS „olvadása”: a bázisok közti H-hídak felbomlanak: megnő az abszorpció DNS „olvadása” Wikipedia

9 Kétsugaras abszorpciós spektrofotométer Fényforrás: széles spektrum szükséges az infrától az UV-ig. Pl. Wolfram lámpa + deutérium lámpa Monokromátor: optikai rács + rés: dsin(Θ m ) = mλ, d: rácsállandó. Rés: jel/zaj és a spektrális felbontás közti kompromisszum Időosztás: chopper Wikipedia, pixshark.com

10 Fluoreszcens spektroszkópia Molekulák viselkedésének sematikus leírása: Jablonski- diagram S: szingulett, T: triplett állapot A foszfereszcencia első rendben tiltott átmenet során jön létre: ezért lassú, nagyon lassú. Pontozott nyíl: intersystem crossing.

11 Fehérjék és DNS fluoreszcens vizsgálata Természetes és mesterséges fluoreszcencia Természetes: fluoreszcens aminosavak: tirozin, triptofán, fenilalanin. DNS autofluoreszcencia. Alkalmazások: molekuláris kölcsönhatások dinamikájának vizsgálata Mesterséges: DNS: interkalálódó DNS festékek (etidium-bromid, propidium- jodid). Ezek hatásfoka 5%-ról közel 100%-ra nő, amikor a DNS kettős hélix nagy árkaiba kötődnek. Fluoreszcens festékek, quantum-dots. Ezek specifitását általában immun antitest adja. Fluoreszcens fehérjék: GFP és rokonai. Génsebészeti jelölés. Ábrák forrása:

12 Fehérjék intrinzik fluoreszcens spektroszkópiája Példa: triptofán környezetének a hatása a fluoreszcens emissziós spektrumra. A hidrofil környezet a magasabb hullámhosszak felé tolja el az emissziós spektrumot. Emissziós spektrumok. 1: Apo-azurin, 2: Ribonukleáz T1, 3: Stafilococcus nukleáz, 4: Glukagon. JR Lakowicz: Principles of fluorescence spectroscopy, Springer 2006

13 Förster típusú energiatranszfer (FRET) spektroszkópia A D donor és az A akceptor közt (sugárzás nélküli) dipól-dipól kh során jöhet létre az energia-transzfer, ha bizonyos feltételek teljesülnek. (R DA << λ.) Ehhez legtöbbször mesterséges D és A jelölő molekularészletekre van szükség. Wikipedia

14 FRET feltétele 1.Fluoreszcens donor- akceptor párok kellenek 2.A D emissziós spektruma átfedést kell, hogy mutasson az A abszorpciós spektrumával 3.DA távolság: <10 nm. 4.Megfelelő orientáció Nature Protocols 8, 265–281 (2013)

15 A FRET mint molekuláris vonalzó Molecules 17(4), (2012)chemwiki.ucdavis.edu

16 FRET: formulák

17 Molekuláris erőmérés FRET-tel I. Nature 466, (2010) Vinculin: struktúrfehérje, a sejtek adhéziójában vesz részt. Vh: feji domén, Vt: farokdomén. a-b: mechanikai feszültséget mérő modul. Az elasztikus polipeptid pókselyem fehérjéből származó nanorugó. G:glicin, P: prolin, A: alanin. c: az erőszenzor beültetése a vinculinba. d: kontroll fehérje csak venus-szal. e: kontroll fehérje farok nélküli vinculin-nal. f, g: A módosított vinculin lokaliációja és dinamikája (photobleaching utáni fluoreszcencia) normális az élő sejtekben.

18 Molekuláris erőmérés FRET-tel II. a: az erőszenzor FRET indexe fibronkektinen (FN) kisebb, mint a mesterséges poli-lizinen összhangban azzal, hogy ilyenkor jelentős mechanikai feszültség épül fel a sejtvázban. e-g: az egyedi erőszenzor molekula kalibrációja optikai csipesszel. Zöld: donor, piros: akceptor emissziója. FRET mozgókép egyedi sejtekről Nature 466, (2010)

19 BRET: Biolumineszcens rezonancia energia transzfer Biolumineszcens donor, fluoreszcens akceptor: nincs szükség külső gerjesztő fényre. A donor általában a luciferáz (szentjánosbogárból) A luciferin a következő reakciót katalizálja: 1.luciferin + ATP → luciferil adenilát + PPi 2.luciferil adenilát + O2 → oxyluciferin + AMP + fény Előnyei FRET-hez képest: kisebb háttér zaj és csökkent „photobleaching”, in vivo vizsgálatokra is alkalmas Fehérje-fehérje kh vizsgálatához Szentjánosbogár, Renilla reniformis, polip kolónia, Wikipedia

20 BRET élő egér tüdejében Rapamicin-indukált FRB-FKB12 kötődés. Rapamicin: immun-szupresszor drog. RLuc8.6: módosított luciferáz, BRET donor. Turbo-FP635: módosított piros fluoreszcens fehérje, BRET akceptor. FRB és FKBP12: egymáshoz kötődő fehérjék. FK506: rapamicin antagonista. Teszt sejttenyészeten, majd az egér vénájába injektálták a BRET fúziós fehérjéket kifejező tumor sejteket. A tumorsejtek eljutottak az egér tüdejébe. In vivo fluoreszcens képalkotás kopasz egereken. PNAS 108, (2011)

21 Biomolekulák kiralitása Királis molekulák: szinte minden biomolekula jobb-bal aszimmetriát mutat. A kiralitás jelentősége a molekulák funkciójában: pl. L-glükóz édes, de nem emészthető a D-glükózzal (szőlőcukorral) szemben! Fehérjeszerkezetben különösen fontos a kiralitás: pl. alfa-hélix vs. béta redő. Neptunea angulata és Neptunea despecta. Wikipedia

22 Kiralitás mérése: CD spektroszkópia A Röntgen krisztallográfia nagy felbontású szerkezeti adatokat ad, de ehhez kristályosítani kell, ami sokszor nehéz vagy szinte lehetetlen. Az NMR oldatban is működik, de csak kisebb fehérjék szerkezetének a megfejtésére. A fentiekhez kiegészítő technika a CD spektroszkópia. Előnyei a következők: 1.Jelölésmentes. 2.Nem igényel kristályosítást: vizes fázisban dinamikai adatok is kimérhetők. 3.Egyszerű, költséghatékony, nem invazív technika. 4.Funkcionális vizsgálatra is alkalmas: ligand bekötése, denaturáció, oligomerizáció időbeli követése, különböző szerkezeti állapotok azonosítása. 5.Elméleti térszerkezeti jóslatok ellenőrzése, pontosítása.

23 Fény polarizációs tulajdonságainak változása anyagon áthaladva A cirkuláris dikroizmus és a cirkuláris kettőstörés két különböző effektus. 1.Cirkuláris kettőstörés: törésmutatóbeli eltérés: Δn = n bal -n jobb Ezt a hullámhossz fv-ében mérve: optikai rotációs diszperzió (ORD) 2.Cirkuláris dikroizmus: abszorpcióbeli (pontosabban extinkciós koefficiensbeli) különbség: Δε = ε bal – ε jobb Mozgóképes demonstráció

24 Matematikai összefüggések a CD spektroszkópiához Cirkuláris dikroizmus: abszorpcióbeli (pontosabban extinkciós koefficiensbeli) különbség: Δε = ε bal – ε jobb Ellipticitás: Θ = arct tg (b/a), ahol b és a az elliptikusan polarizált fényt ellipszisének kis és nagy tengelye. Moláris ellipticitás [Θ] = 100 Θ/lc [Θ] = Δε [deg*cm 2 /dmol]

25 Fehérjék szerkezetének vizsgálata CD spektroszkópiával Két tartomány: Közeli UV: nm. Ezt az aromás oldalláncok és ezek egymáshoz viszonyított térbeli helyzete határozza meg. Fehérjék harmadlagos szerkezetére jellemző. Távoli UV: nm. Ezt az amid kötések adják. Másodlagos fehérjeszerkezetre jellemző. Pl. alfa- hélix, béte-szerkezet, rendezetlen láncok. Ezek megléte és aránya. Fehérjék másodlagos szerkezete. Két általános struktúra

26 Fehérjék másodlagos térszerkezetének vizsgálata CD spektroszkópiával A mért spektrumot ismert szerkezetek spektrumainak lineáris kombinációjával közelítik. Legegyszerűbb esteben: [Θ(λ)] = α[Θ α λ)]+ β[Θ β (λ)] + r[Θ r (λ)], ahol α, β és r az alfa-hélix, béta-szerkezetű és random szerkezetű szintetikus polipeptidek referencia spektrumának súlya az adott fehérje szerkezetében. Bonyolultabb esetben valódi, ismert szerkezetű bázis fehérjék spektrumának lineáris kombinációjával számolnak. Nature Protocols 1(6): 2876–2890 (2006)

27 Optikai hullámvezető spektroszkópia 1.A hullámvezetőben teljes visszaverődésekkel terjedhet a fény. 2.Csak diszkrét módusok tudnak terjedni,melyek diszkrét becsatolási szögek mellett jönnek létre. 3.A kisebb törésmutatójú térrészbe evaneszcens fény hatol be. 4.A becsatolás szöge nagyon érzékeny a fedő réteg törésmutatójára. Analyst 136, (2011)

28 Optikai hullámvezető spektroszkópia alkalmazásai High-throughput: EPIC BT, Corning OWLS előnyei: csak az evaneszcens, néhány 100 nm-es rétegre érzékeny. Nagyon kis törésmutató-változásokat ki tud mutatni. pm-es hullámhosszeltolódás mérhető: a törémutató 5. jegyéig érzékeny! Jelölésmentes technika. Alkalmas kis és nagy molekulák detektálására. Jó időbeli felbontás Nagy áteresztőképesség Maxwell egyenletek megoldhatók az egyszerű geometriában, ill. viszonylag könnyen szimulálhatók, ha a geometria bonyolult. A felület molekuláris szinten kézben tartható, ez adja a mérés specifitását

29 Raman spektroszkópia Fizikai háttér: a fény rugalmatlan szóródása. Alkalmas molekulák vibrációs és rotációs gerjesztések vizsgálatára. Technikai nehézség: direkt nyaláb kiszűrése: „band-stop” („notch”) filter szükséges. Ezek destruktív interferencián alapulnak. Wikipedia

30 Raman spektroszkópia alkalmazásai A vibrációs spektrum jellemző a molekula kémiai kötéseire és a molekula szimmetriáira. Molekuláris „ujjlenyomatot” ad. Szerves molekulák esetén cm-1 tartományban. Gerjesztés NIR lézerrel. Raman mikroszkópia. (Nagy térbeli feloldású Raman spektroszkópia.) Élő sejtek Raman spektruma, Sensors 10(3), (2010)


Letölteni ppt "Szerkezetvizsgálati módszerek a biofizikában 2016 tavaszi félév Czirók András, Szabó Bálint Elérhetőség: 3.146-os szoba,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések