Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló.

Az előadások a következő témára: "Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló."— Előadás másolata:

1 Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek MHC tipizálás Hiperszenzitivitási reakciók (allergia és más túlérzékenységi reakciók) (a diasorhoz tartozik a pro5.exe (4414KB) animációt tartalmazó fájl)

2 „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (high throughput) citokin vizsgálatok (proteomika)

3 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának főbb folyamatai, és azok vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul - FRET

4 Az elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló vizsgálatokban az antigén mennyiségével arányos mértékű az a megjelenő jel Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

5 Cytokine array A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít ( - ) IFN  ( + ) IL-2IL-4… … MIP3β… különféle kikötött specifikus ellenanyagok Vizsgálandó citokin tartalmú oldat Jelzett ellenanyagok keveréke Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

6 CD40L és CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokin termelése Réthi és mtsi. 2006

7 „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok (áramlási citométerrel) (proteomika) Az eljárás kis térfogatokkal (5-20  l) is működik, de műszerigényes.

8 Cytometric/multiplex bead array (CBA) A cyitokine array-hez hasonló alapelvű áramlási citometriás módszer. A citokineket itt nem a pozíciójuk, hanem különböző színintenzitású gyöngyök azonosítják CBA cytokine array IL-2 IL-4 IL-8 … … IL-12IL-23IL-17……

9 A CBA elve és összehasonlítása a hagyományos ELISAval Szendvics ELISACBA Cytometric/multiplex bead array (CBA) IL-2 capture ellenanyagok IL-2 IL-4 IFN  IL-2 „reporter” ellenanyag

10 IL-8 IL-1β IL-6 IL-12IL-10 TNFα Citokin mennyiség Citokin standard hígítási sorozat 500pg/ml250pg/ml125pg/ml62pg/ml31pg/ml16pg/ml8pg/ml 0 A citokinek mennyiségére az eltérő színnel jelölt „reporter” ellenanyag fényintenzitásából következtethetünk

11 A citokin array és a citokin bead array módszerekhez hasonlóan bármilyen antigén kimutatására alkalmas összeállítások létrehozhatók. PROTEIN ARRAY & PROTEIN BEAD ARRAY pl. intracelluláris jelátviteli folyamatok vizsgálata: mennyiségének arányának módosított és módositatlan (foszforilált, ubiquitinált, ….) jelátvivő molekulák mennyiségének és egymáshoz képesti arányának vizsgálata a sejtaktiváció folyamata során

12 T-sejtek funkcionális vizsgálata Antigén specifikus T-sejtek azonosítása immunizálás Hasznos lehet pl. immunizálás eredményességének vizsgálatakor antigén specifikus T-sejt Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak. T-sejt klónok ugyanolyan T-sejt receptorral

13 De az MHC kötődése a T-sejt receptorhoz kis affinitású egy MHC molekula és T-sejt receptor kölcsönhatása nem elég erős Megjelölt MHC-peptid komplex felhasználható a rá specifikus T-sejt receptor kimutatására MHC T-sejt receptorok T-sejt

14 Pentamer (vagy tetramer) technika a létrejövő pentamer self assembling coiled-coil-domain MHC peptid fluoreszcens jelzés a pentamer egyik alegysége Multimerizált MHC-peptid komplex aviditása már kellően erős lehet.

15 peptid-specifikus T-sejt MHC pentamer Az MHC pentamer kötődése a T-sejthez Az MHC-peptid oligomer reakciója a specifikus T-sejt receptorokkal nagy aviditású. T-sejt receptorok Ide kattints az animációhoz MHC multimerek segítségével meghatározható az antigén-specifikus T-sejtek száma, értékelhető pl. a vakcinák, vagy egy adott terápiás eljárás hatékonysága.

16 MHC Dextramerek

17 CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban EBV BZLF-1 (RAKFKQLL/ HLA-B*0801)-specifikus T-sejtek (a normál populáció 90-95%-a hordozó) Influenza epitóp (GILGFVFTL/ HLA-A0201)-specifikus T-sejtek egészséges donorban MHC multimer jelöléses példák A perzisztáló vagy visszatérő fertőzések miatt a specifikus T- sejtek száma viszonylag magas lehet a szervezetben A vizsgálat alapfeltétele a vizsgálandó T sejtek MHC specificitásának ismerete (MHC restrikció)

18 allélszekvencia Tumor (asszociált) epitop peptid eredete A*0201GVLVGVALICarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 694-702 A*0201LLGRNSFEVp53 261-269 A*0201LLLLTVLTVMUC-1 12-20 A*0201RLLQETELVHER-2/neu 689-697 A*0201RMFPNAPYLWilm's Tumour (WT1) 126-134 A*0201SLLMWITQVNY-ESO-1 157-165 A*0201STAPPVHNVMUC-1 950-958 A*0201VISNDVCAQVProstate Specific Antigen-1 (PSA-1) 154-163 A*0201VLQELNVTVLeukocyte Proteinase-3 (Wegener's autoantigen) 169-177 A*0201VLYRYGSFSVgp100 (pmel17) 476-485 A*0201YLEPGPVTAgp100 (pmel17) 280-288 A*0201YLSGANLNLCarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 571-579 A*0201KVLEYVIKVMAGEA1 278-286 A*0201KVAELVHFLMAGEA3 112-120 A*0201KTWGQYWQVgp100 (pmel17) 154-162 A*0201HLSTAFARVG250 (renal cell carcinoma) 217-225 A*0201ILAKFLHWLTelomerase 540-548 A*0201ILHNGAYSLHER-2/neu 435-443 A*0201IMDQVPFSVgp100 (pmel17) 209-217 A*0201KIFGSLAFLHER-2/neu 348-356 A*0201LMLGEFLKLSurvivin 96-104 A*0201ALQPGTALLProstate Stem Cell Antigen (PSCA) 14-22 A*0201CMTWNQMNLWilm's Tumour (WT1) 235-243 A*0201ELAGIGILTVMelanA / MART 26-35 A*0201FLTPKKLQCVProstate Specific Antigen-1 (PSA-1) 141-150 A*0201GLYDGMEHLMAGEA-10 254-262 A*0301KQSSKALQRbcr-abl 210 kD fusion protein 21-29 A*0301ATGFKQSSKbcr-abl 210 kD fusion protein 259-269 A*0301ALLAVGATKgp100 (pmel17) 17-25 A*2402VYGFVRACLTelomerase reverse transcriptase (hTRT) 461-469 A*2402TYLPTNASLHER-2/neu 63-71 A*2402TYACFVSNLCarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 652-660 A*2402TFPDLESEFMAGEA3 97-105 A*2402EYLQLVFGIMAGEA2 156-164 A*2402CMTWNQMNLWilm's Tumour (WT1) 235-243 A*2402AFLPWHRLFTyrosinase 188-196 B*0801GFKQSSKALbcr-abl 210 kD fusion protein 19-27 allélszekvencia EBV epitop A*0201CLGGLLTMVEBV LMP-2 426-434 A*0201GLCTLVAMLEBV BMLF-1 259-267 A*1101IVTDFSVIKEBV EBNA-4 416-424 A*2402TYGPVFMCLEBV LMP-2 419-427 B*0702RPPIFIRRLEBV EBNA-3A 247-255 B*0801FLRGRAYGLEBV EBNA-3A 193-201 B*0801RAKFKQLLEBV BZLF-1 190-197 B*3501HPVGEADYFEYEBV EBNA-1 407-417 allélszekvencia Influenza A epitop A*0101CTELKLSDYInfluenza A (PR8) NP 44-52 A*0201GILGFVFTLInfluenza A MP 58-66 A*0301ILRGSVAHKInfluenza A (PR8) NP 265-274 allélszekvencia HIV epitop A*0201ILKEPVHGVHIV-1 RT 476-484 A*0201KLTPLCVTLHIV-1 env gp120 90-98 A*0201SLYNTVATLHIV-1 gag p17 76-84 A*0201TLNAWVKVVHIV-1 gag p24 19-27 A*0301QVPLRPMTYKHIV-1 nef 73-82 A*0301RLRPGGKKKHIV-1 gag p17 19-27 A*2402RYLKDQQLLHIV-1 gag gp41 67-75 B*0702IPRRIRQGLHIV-1 env gp120 848-856 B*0702TPGPGVRYPLHIV-1 nef 128-137 B*0801FLKEKGGLHIV-1 nef 90-97 B*0801GEIYKRWIIHIV-1 gag p24 261-269 B*2705KRWIILGLNKHIV-1 gag p24 265-274 H-2KdAMQMLKETIHIV-1 gag p24 199-207 Antigén specifikus T sejtek kimutatására alkalmas MHC-peptid pentamer példák A vizsgált személy szövettípusának megfelelő MHC multimer szükséges hozzá

19 MHC TIPIZÁLÁS és A TRANSZPLANTÁCIÓS IMMUNOLÓGIA GYAKORLATI VONATKOZÁSAI rengeteg allélvariáció a populációban emberi MHC antigének  HLA antigének  HLA tipizálás MHC I: HLA-A, HLA-B, HLA-C MHC II: HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR laboratóriumi egér MHC antigének  H2 antigének  H2 tipizálás MHC I: H2D, H2K, (H2L) MHC II: H2 I-A, H2 I-E (Miért nem kell a laboratóriumi egereket tipizálni?)

20 HLA tipizálás - szövet/szerv transzplantációkhoz általában a HLA-B és a HLA-DR a legfontosabb a HLA-C kevéssé immunogén, gyakran alig befolyásolja a transzplantáció eredményét - diagnosztikai értéke van HLA és a különféle betegségek között összefüggés lehet (HIV-rezisztenciával kapcsolatos esetek egy része is adott HLA-B allélhez köthető) MHC I: HLA-A, HLA-B, HLA-C MHC II:HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR Fogalmak HLA típusokkal és transzplantációval kapcsolatban: autológ - saját eredetű (MHC azonos) allogén - idegen személyből származó (MHC különbségek) xenogén - idegen fajból származó (MHC és más antigén pl.„vércsoport” különbségek is)

21 Hiperakut rejekció Okok: alloantigénekkel szembeni előzetes immunizácó, preformált anti-HLA ellenanyagok, ABO- vércsoport inkompatibilitás, xenotranszplantáció antitestek kötődnek a szerv endotél sejtjeihez komplementrendszer aktiválódása trombózis vascularis necrosis terápia rezisztens Transzplantációs reakciók (allorektivitás) HLA-A, B, C, DR, DQ, DP, és minor hisztokompatibilitási antigének jelentősége idegen MHC-antigének T sejtek általi felismerése Direkt: saját T sejtek - donor APC-k (CD8+ T sejt válasz) Indirekt: saját APC bemutatja a donor MHC-molekula katabolizmusából származó fragmenteket (CD4+ T sejtek) citokin felszabadulás GYULLADÁS

22 forrás: Klinikai immunológia (II. klinikum) (OHVI 1990 szerk.: Szegedi, Gergely, Sipka, Szemere) Stenszky Valéria: Autoimmun betegségek genetikai vonatkozásai Betegségek (autoimmun) HLA gyakoriság betegkontroll SLE DR35520 B85020 Hidralazin(?) indukált lupus erythematosus DR47332 Basedow-kór DR35625 B84320 Krónikus aktív hepatitisDR35521 Sclerosis multiplex DR26030 B73724 Myasthenia gravisB84420 Autoimmun IgA glomerulonephritis DR45319 I. típ. diabetes DR37224 DR34922 B84021 Addison-kór (idiotópiás, autoimmun) DR37020 B84623 Sjörgen-szindróma DR37020 B85022 Coeliaka DR37922 DR76015 B86822 Goodpasture-szindrómaDR28829 IgA hiányDR38120 Dermatitis herpetiformis DR38220 B87522 De Qervain-thyreoiditisB357015 Reiter-szindrómaB27799 Felty-szindrómaDR49520 BetegségekHLA gyakoriság betegkontroll NarcolepsiaDR210022 Bechterew-kórB27899 Adrenogenitális szindróma Sóvesztő forma Késői forma Virilizáló forma Bw47361 B14574 B54810 Psoriasis vulgaris Cw65615 B13248 B17278 DR74823 Idiopátiás haemochromatosisA37628 Bechet-kórB515011 Arany indukált thrombocytopeniaDR35013 Arany indukált leukopéniaDR34713 HLA allotípusok és betegségek közötti kapcsolatok

23 A régi klasszikus IMMUNOLÓGIAI módszer: Szerotipizálás A tipizálandó vérsejtek és a tipizáló szérum közötti szerológiai reakción alapul. Az MHC I és/vagy MHC II molekula változatokat felismerő ellenanyagokat tartalmazó szérumok segítségével véghez vitt komplement mediált lízis/sejtkárosítás. Ha a tipizáló szérum nem reagál a sejtekkel, nincs lízis (az elpusztult/károsodott sejteket festék hozzáadásával teszik láthatóvá) A tipizáló szérumokat régen immunizálódott személyektől gyűjtötték (pl. többször szült nők, vérátömlesztést kapott személyek - többféle MHC allél ellen immunizálódtak), ezt később monoklonális ellenanyagokkal váltották ki. HLA tipizálási módszerek: A szérumok/ellenanyagok specifitásának jellemzése és az új HLA allélek azonosítása nemzetközi workshopok keretében történik. A rendelkezésre álló, jól karakterizált szérumok mennyisége mindig limitált – ezért mikrotiter tálcákon végzik a vizsgálatokat (mikrocitotoxicitási vizsgálat, Terasaki plate)

24 Az MHC II (HLA-DP, DQ, DR) allotípusokat B sejteken vizsgálják perifériás vér, Ficoll gradiens  PBMC PBMC, olcsó nylonvatta szlop  dúsított B sejtek Szerotipizálás Az MHC antigének kompatibilitását kevert limfocita reakcióval (MLR) is vizsgálhatják. -Kétirányú MLR – mindkét donor T limfocitái válaszolnak -Egyirányú MLR – az egyik személy limfocitáinak osztódását gátolják (γ besugárzás, sejtosztódás gátló Mitomycin C kezelés ) AZ ALLOREAKTÍV AKTIVÁLÓDÓ LIMFOCITÁK ARÁNYA EGY ADOTT EGYEDBEN NAGYON MAGAS LEHET (1-10%) (alloreaktivitás és MHC restrikció látszólagos paradoxonának szemléletes feloldása: az allogén MHC a saját T sejt számára úgy „látszik”, mintha saját MHC lenne idegen peptiddel)

25 A szerotipizálásnak vannak korlátai: – gyakori keresztreakciók (HLA-B27 – HLA-B7, nem csak a poliklonális szérumok miatt ) – HLA-C ellen (alacsony immunogenitású), kevés a specifikus szérum – egyes variációkat, kis eltéréseket nem képes detektálni Szerológiai módszerekkel a változatok töredékét lehet csak kimutatni! Genetikai vizsgálatok - PCR-SSP (Sequence Specific Primer) ismert a szekvenciájú allélek azonosítása Különféle egyedi HLA szekvenciákra specifikus primerekkel elvégzett sokmintás PCR vizsgálat. Az allél specifikus primerpárok segítségével, a PCR reakcióban megsokszorozott génszakaszok kimutathatók az agaróz gélben HLA-A 0201 0202 0203 …

26 -PCR-SSOP (Szekvencia Specifikus Oligonokleotid Próba) Jelzéssel ellátott, allél specifikus oligonukleotidok hibridizációja a vizsgált személy DNS mintájához. A vizsgálandó személy HLA génszakaszait PCR–rel sokszorosítják (nem allél specifikus primerekkel). A terméket nitrocellulóz membránon vagy mikrotiter tálcákon immobilizálják és különféle allél specifikus jelölt oligonukleotidokkal hibridizálják. A jelölés lehet radioaktív, enzim vagy fluoreszcens. – példát lásd a következő diákon (ELPHA ) -SBT (Sequence Based Typing) DNS szekvenálással állapítják meg az allotípust (egészen kis eltérések, és új változatok is kimutathatóak vele) Genetikai vizsgálatok

27 - Vérből szeparált PBMC-ből genom DNS izolálás - Az MHC II gének 2. exonjának és az MHC I gének 2. és 3. exonjának amplifikálása PCR-reakcióval. A primerek nem allél specifikusak, és biotinnal jelöltek. ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay) (1. lépés) DPDQDRBCA Egy gyakorlati példa PCR-SSOP-re: Felsokszorozott MHC „gén lokuszok”

28 A PCR amplifikátumot mikroteszt („ELISA”) lemez lukjaiba osztják szét. A lukak alja sztreptavidinnel fedett, és az egyes lukak liofilizált formában tartalmazzák a különféle allélszakaszokkal komplementer szekvencia specifikus oligonukleotidokat (SSOP). Sztreptavidin A biotinált amplifikátum kikötődik a sztreptavidinre, és egyidejűleg visszaoldja az allél specifikus oligonukleotidokat. biotinált PCR amplifikátum A komplementer szekvenciák hibridizálnak, és a mosás után csak az adott allélekre specifikus oligonukleotidok maradnak a lemezen. Az oligonukleotidokon levő jelzést pl. enzim konjugált ellenanyag ismeri fel. Az enzim megfelelő szubsztráttal színreakciót katalizál. ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay) (2. lépés) (Jelen esetben az oligonukleotidon levő jelzés nem lehet biotin, mert az „foglalt”. Lehet pl. digoxigenin, vagy FITC. A FITC ebben az esetben nem fluoreszcens jel, hanem ún. „tag”) allél specifikus oligo

29 pl. HLA-A tipizáló lemez (3.lépés) HLA-A0276 HLA-A2434

30 szekvencia alapon 2006 októberéig leírt HLA-A allélek (480db) (egy régebbi nomenklatúra szerint) (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/allele.html) és a szerológiai alapon jellemzett HLA-A allélek (28db): A leírt allélek száma évről évre nő: 2014: 2579 HLA-A allél 1833 HLA-A fehérje 87 null allél

31 2014-es HLA nomenklatúra A szekvenálás térhódításával rengeteg új allélt/változatot mutatnak ki, ezért a nomenklatura rendszeres frissítésre szorul http://hla.alleles.org/ 2014 januárjáig 10533 különböző HLA allélt (A,B,C, DP, DQ, DR,…) írtak le

32 TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK

33 Ártalmatlan anyagok bejutása egyes emberekben túlérzékenységi reakciókat válthat ki Nemkívánatos gyulladáshoz, sejtek és szövetek károsodásához vezet Az immunrendszer az idegen anyagra nem megfelelően reagál Többnyire ártalmatlan anyagok hatására alakul ki, másodszori (esetleg többszöri) találkozás eredményeként

34 TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK ÁTTEKINTÉSE I. típusú „azonnali” II. típusúIII. típusúIV. típusú „késői” Ellenanyag mediáltT sejt mediált az elején szenzitizációval indulnak gyakran autoimmun megbetegedésekkel kapcsolatban a típusok effektor mechanizmusai átfedhetnek – tünetek egy része hasonló lehet gyakori hogy nem tisztán az egyik vagy a másik típus jelenik meg, lehetnek átfedőek is (Type I és Th2 Type IV összefügghet vagy a Type IV kontakt dermatitisz neoepitopjai ellen Type II-re jellemző ellenanyagok is termelődhetnek)

35 AZ ELLENANYAG MEDIÁLT TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK TÍPUSAI Ellenanyag izotípus Antigén Effektor mechanizmus Példa Szolubilis antigén Hízósejt aktiváció Allergiás rhinitis, asthma bronchiale, anaphylaxia Szolubilis antigén Komplement, fagociták Sejtfelszíni receptor Sejtfelszíni vagy mátrix- kötött antigén Az ellenanyag megváltoztatja a jelátvitelt Komplement, Fc  R + sejtek (fagociták, NK-sejtek) Egyes gyógyszer- allergiák (pl. penicillin) Krónikus urtikária (ellenanyag az Fc  RIα ellen) Szérumbetegség, Arthus-reakció II. típusIII. típus I. típus IgM, IgM

36 I.TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ („azonnali hiperszenzitivitási reakció”) ALLERGIA

37 A szenzitizáció folyamata Első találkozás a pollennel Az antigén bejutása, felvétele Antigén- specifikus T-sejtek aktivációja IgE termelés és azok kötődése a hízósejtek felszínéhez (Az antigénprezentáció a naív T sejtek számára és a naív B sejtek aktivációja természetesen a másodlagos nyirokszervekben történik)

38 AZ ALLERGÉN HATÁSÁRA A HÍZÓSEJTBEN KIVÁLTOTT REAKCIÓK KORAI MEDIÁTOROK Biogén aminok – hisztamin Enzimek – triptáz, kináz, karboxipeptidáz KÉSŐI MEDIÁTOROK

39 citokin kemokin lipid- mediátor enzim toxikus mediátor Termék típusa Termék Biológiai hatások kötőszöveti ‘remodelling’ toxikus a parazitákra növeli az erek permeabilitását simaizom összehúzódáshoz vezet gyulladáskeltő, különböző sejttípusok citokintermelését serkenti, aktiválja az endotéliumot TNFα (egy része granulumokban raktározva) simaizom összehúzódáshoz vezet növeli az erek permeabilitását serkenti a nyáktermelést serkentik és erősítik a Th2-választ granulocita termelés és aktiválás monocita, makrofág és granulocita toborzás leukociták toborzása, lipidmediátorok felszabadulásának serkentése, neutrofilok, eozinofilok és trombociták aktiválása A TNF  tároltan is megtalálható, és késői mediátor is korai (tárolt) mediátorok

40 Az allergia akut és krónikus fázisa Az eozinofilok által termelt toxikus anyagok  szövetkárosítás

41 A hízósejt degranuláció hatása függ a szöveti környezettől Hányás, hasmenés, hasi görcsök Köhögés, mellkasi szorítóérzés, sípoló légzés Ödéma, gyulladás és megnövekedett antigénszállítás a nyirokcsomókba Hízósejt aktiváció és degranuláció Emésztőrendszer Légutak Vérerek Megnövekedett emésztőnedv szekréció és perisztaltika Csökkent átmérő és megnövekedett nyáktermelés Megnövekedett vérátáramlás és permeabilitás

42 A vérbe jutó allergének hatására anafilaxia alakul ki Hízósejt degranuláció és gyulladásos mediátorok felszabadulása Szív és érrendszer Légzőrendszer Emésztőrendszer Simaizom kontrakció Broncho- konstrikció, nehézlégzés, sípolás Simaizom kontrakció Hányás Folyadék- kiáramlás a bél lumenbe  hasmenés vér kapilláris IgE-fedett hízósejtek Az antigének a véráramból a szövetekbe lépnek és test szerte aktiválják a szöveti hízósejteket Anafilaxiás sokk: kapiláris permeabilitás megnő  ödéma  a szövetek megduzzadnak (nyelv) vérnyomáscsökkenés  szövetek csökkent oxigenizációja ESZMÉLETVESZTÉS

43 AZ IgE ÁLTAL KÖZVETÍTETT HIPERSZENZITIVITÁS TÍPUSAI SZINDRÓMAGYAKORI ALLERGÉNEK A BELÉPÉS HELYEVÁLASZ szisztémás anafilaxis gyógyszerek állati mérgek földi mogyoró intravénás (közvetlen vagy szájon át történő felszívódás ödéma ér áteresztő képesség növekedése tracheális okkluzió keringés összomlása halál akut urtikáriarovar csípés allergia teszt szubkutána véráram lokális fokozódása éráteresztő képesség növekedése Allergiás rinitisz szénanátha pollen házi atka ürülék belégzésorr nyálkahártya ödéma orr nyálkahártya irritáció asztmaállatszőr pollen házi atka ürülék belégzéslégutak szűkülete fokozott nyálka képződés légutak gyulladása étel allergiacsonthéjasok földimogyoró halak, kagyló tej, tojás szájon áthányás hasmenés pruritusz (viszketés) urtikária (csalánkiütés) anafilaxis (ritka)

44 Hízósejtek működésének vagy antigén specifikus IgE jelenlétének vizsgálata kísérleti állatmodellben: Passzív kután anafilaxis (PCA) A bőrbe szenzitizált élőlény szérumát, vagy antigén specifikus IgE ellenanyagokat juttatnak lokálisan ( „lokális passzív immunizálás ”). Egy két nap elteltével intravénásan juttatnak az állatba antigént, és jelzőfestéket (Evans-blue – albuminhoz kötődik a keringésben) A kisméretű antigén a korábbi oltás helyén kiváltja az IgE hordozó hízósejtek aktivációját. A hisztamin hatására megnő a helyi kapillárisok permeabilitása, a kék festék kijut a szövetbe – kék elszíneződés az oltás helyén

45 Mc-cpa−/− mast cells mount a normal passive cutaneous anaphylaxis reaction. Thorsten B. Feyerabend et al. Mol. Cell. Biol. 2005;25:6199- 6210

46 Parlagfű (Ambrosia artemisiifolia)

47 Fekete üröm (Artemisia vulgaris) levélfonák zöld levélfonák fehéresen molyhos

48 Fekete üröm (Artemisia vulgaris) –? Fehér üröm (Artemisia absinthium) – Abszint (tujon: max 35 mg/l)

49 Hízósejt degranuláció, allergiás reakció szenzibilizált személy bőrében Prick-teszt a késői mediátorok (pl. lipid metabolitok) által okozott ödéma nagyobb kiterjedésű is lehet

50 Prick teszt

51 ImmunoCAP specifikus IgE molekulák kimutatása vérből 1. szérum előkészítése 2. inkubáció 3. jelölés/kimutatás

52 II. TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ Sejtfelszíni vagy szöveti antigénhez specifikusan kötődő IgG ellanyagok az antigént kifejező sejtek érzékennyé válnak a komplement függő lízissel és/vagy az opszonizált fagocitózissal szemben frusztrált fagocitózis (lítikus enzimek szabadulnak ki)  szövetkárosodás az ellenanyag gátolja vagy stimulálja a sejt funkcióját nincs direkt szövet károsodás (pl. acetilkolin receptor blokkoló autoantitestek Myasthenia gravisban, vagy Basedow-Graves kór TSH receptor stimuláló ellenanyagok)

53 A II. TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ MECHANIZMUSAI Fc γ RIII a célsejtek elpusztítása az effektor NK-sejt vagy makrofág által a célsejtek elpusztítása komplement-mediált lízis által a receptor ellenes autoantitest megváltoztatja a jelátvitelt, blokkolja vagy indukálja a receptorfunkciót

54 A nem fagocitálható szövet károsodik Abszorbeált (gyógyszer) antigén FRUSZTRÁLT FAGOCITÓZIS SZÖVETI ANTIGÉNEKET FELISMERŐ IgG ELLENANYAGOK KÖZVETÍTÉSÉVEL Kötődés Opszonizáció Internalizáció Opszonizált felület Kötődés Enzim felszabadulás Frusztrált fagocitózis Enzim felszabadulás

55 Néhány példa II-es típusú túlérzékenységi reakcióra Újszülöttek hemolitikus anémiája Transzfúziós reakció (IgG, IgM) Hiperakut allograft kilökődés Gyógyszer által kiváltott –Hemolitikus anémia –Trombocitopénia –Agranulocitózis például  Penicillin alapú antibiotikumok  Anti-aritmiás quinidin (szívritmus szabályzó hatóanyag) Goodpasture szindróma (vese, bazális membrán, IV kollagén) Pemphigus vulgaris (nyálkahártya hólyagok)  dezmoszómális antigének ellen, epidermális és mukozális kapcsolatok roncsolása, akantolízis (sejtekre esés) Myasthaenia gravis (acetil-kolin receptor elleni gátlóantitest) Basedow-kór (TSH-receptor elleni serkentő antitest)

56 A GYÓGYSZER ÉRZÉKENYSÉG KIALAKULÁSÁNAK MECHANIZMUSA I. Bakteriális transz- peptidáz inaktiválása Saját sejtfelszíni fehérjék módosítása Komplement kötődése, opszonizáció Módosult fehérjékből származó peptidek prezentálása Th2 sejtek aktiválják a módosult fehérje antigénekre specifikus B-sejteket Ellenanyag termelés az aktivált B- sejtekből képződő plazmasejtek által Neoepitop! szenzitizáció

57 A GYÓGYSZER ÉRZÉKENYSÉG KIALAKULÁSÁNAK MECHANIZMUSA II. A penicillin-specifikus ellenanyagok kötődnek a módosított fehérjékhez A sejtek pusztulása komplement-mediált lízis útján A sejtek pusztulása opszonizációt követő fagocitózis útján effektor fázis

58 Az oldott antigénekhez kapcsolódó ellenanyagok kisméretű cirkuláló majd különféle helyeken lerakódó immunkomplexeket hoznak létre az immunkomplex mérete függ: az antigén-ellenanyag aránytól, az ellenanyag affinitásától, az ellenanyag izotípusától, az ellenanyag valenciájától (lásd precipitáció – agglutináció szeminárium) autoimmun betegségekben antigéntúlsúly van A nagyméretű immunkomplexeket a fagocita sejtek gyorsan eltüntetik, kevesebb problémát okoz (lásd Fc receptorok) III. TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ (IMMUNKOMPLEX BETEGSÉGEK)

59 AZ IMMUNKOMPLEXEK ÁLTAL OKOZOTT SZÖVETKÁROSODÁS FOLYAMATA Az immunkomplexek aktiválják a komplementrendszert, a neutrofil és bazofil granulocitákat és a trombocitákat A szövetekbe kijutó anafilatoxinok (pl. C5a) aktiválhatják a hízósejteket is. Érfal permeabilitás Frusztrált fagocitózis effektor folyamatok

60 III TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ TÜNETEI AZ IMMUNKOMPLEXEK LERAKÓDÁSÁNAK HELYÉTŐL FÜGGENEK Intravénás (magas dózis) szubkután belégzés Bejutás Kialakuló kórkép Immunkomplex lerakódás helye vaszkulitisz nefritisz artritisz Arthus- reakció Farmer- tüdő Érfal Glomerulusok Ízületek Perivaszkuláris területek Alveolokapilláris határfelület Ezek a képek klasszikus szérumbetegség vaszkulitiszes tüneteit illusztrálják

61 Arthus-reakció (Indukált) lokalizált III-as típusú túlérzékenységi reakció (bőrben) Lokális vaszkulitisz alakul ki a lerakódó immunkomplexek miatt Légzéssel a szervezetbe kerülő antigének (penészgomba, állati ürülék) is hasonló folyamatot váltanak ki a tüdőben  Pl. farmertüdő és galambtenyésztő tüdő penészgomba és galamb toll/ürülék fehérje antigének miatt IgG izotípusú az ellenanyag

62 Pillangó eritéma ("butterfly rash„) egy discoid lupus erythematosus (DLE)-s beteg arcán. A DLE csak a bőrt érinti és kevésbé rossz indulatú mint a szisztémás lupus erythematosus (SLE). Mindkét esetben a napfény hatására az eritéma erősödik. A DLE betegek 5-10%-ában, akik ANA pozitívak, SLE fejlődik ki. Súlyos gyulladás SLE beteg felső dermiszében. A bazális réteg vacuolizálódik és szétesik, a pírt okozó purpura vörösvérsejteket tartalmaz. III TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉG LUPUSZOS BETEGBEN

63 Immunofluorescencia festés komplement ellenes ellenanyaggal. Az immunkomplexek a dermális – epidermális határnál rakódnak le. Immunofluorescencia festés IgG ellenes ellenanyaggal. Az immunkomplexek a dermális – epidermális határnál rakódnak le. DLE esetében az immunkomplexek jelenléte csak a bőr pirult részein, SLE esetében mindenütt kimutathatók. IMMUNKOMPLEXEK LERAKÓDÁSA SLE BETEG BŐRÉBEN

64 Glomerulus lupus nephritisben. A kapilláris hurkok rózsaszínűek és megvastagodottak, így a kapilláris lumenek alig láthatók. Megvastagodott rózsaszín kapilláris hurkok („huzal hurkok”) lupus nephritis-ben. VESE KÁROSODÁS IMMUNKOMPLEX BETEGSÉGEKBEN

65 Jellegzetes „rim” (karima) mintázat SLE-ben. „Speckled” (pettyes) mintázat extrahálható nukleáris antigének (ribonukleoproteinek) ellen irányuló autoantitestek esetében. Leggyakrabban kevert kötőszöveti betegség (MCTD) esetén tapasztalható, ami az SLE, scleroderma és polymyositis keverékének tekinthető betegség, de komoly vese- vagy tüdőbetegség nem kíséri. „Nucleoláris mintázatú" festődés Hep2 sejteken, ami progresszív szisztémás szklerózisban a legkifejezettebb. ANA AZ AUTOIMMUN KÓRKÉPEK OSZTÁLYOZÁSA, DIAGNOSZTIZÁLÁSA ÖSSZETETT FELADAT

66 IV. TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ (késői típusú túlérzékenységi reakció) T-SEJT KÖZVETÍTETT FOLYAMAT (antigén prezentáció)

67 IV-es típusú túlérzékenységi reakció IV Típus Makrofág aktiváció Eozinofil aktivációCytotoxicitás Szolubilis antigén Szolubilis antigén Sejt asszociált antigén Th1 sejtTh2 sejtCTL Effektor mechanizmusok Antigén Példa a hiperszenzitivitási reakcióra Immunsejt Kontakt dermatitisz, Tuberkulin próba Krónikus asthma, Krónikus allergiás rhinitis Kontakt dermatitisz Kemokinek, citokinek citotoxikus anyagok gyulladásos mediátorok

68 T sejt mediált, IV-ES TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK SZINDRÓMAANTIGÉNKÖVETKEZMÉNY Késői típusú túlérzékenység Fehérjék Rovar fehérje Mikobakteriális fehérje (tuberkulin, lepromin) Lokális bőr duzzanat: Eritéma Induráció (megkeményedés) Sejtes beszűrődés Dermatitisz Kontakt túlérzékenység Haptének Pentadeka-katekol (poison ivy) DNFB (dinitrofluorobenzene) Kis fém ionok Nikkel, króm Lokális bőr reakció Eritéma Sejtes beszűrődés Hólyagok Intra-epidermális gócok Glutén szenzitív enteropátia Gliadin (gabonafehérje) Endomízium (izomrostokat körülvevő kötőszövet) Transzglutamináz A vékonybél csillók atrófiája Alultápláltság Hasnyálmirigy exokrin szekréciója károsodik

69 Késői típusú (IV-es) túlérzékenység APC által behozott antigén felismerés a limfoid szövetekben T-sejt expanzió és differenciáció Differenciált effektor T-sejtek belépnek a keringésbe Szenzitizáció CD4+ effektor Th1 sejtek CD8+ T-sejtek (CTL) 1. szenzitizáció

70 2. Késői típusú (IV-es) túlérzékenység 3. Effektor T-sejtek vándorlása az antigén lokalizáció helyére Makrofág aktiváció Fagocitált mikróbák pusztítása Differenciált effektor T-sejtek a keringésben Effektor T-sejtek a perifériás szövetekben találkoznak az antigénnel Effektor sejtek aktivációja Fokozott leukocita toborzás „immun gyulladás” effektor fázis

71 Késői típusú túlérzékenység (DTH) pl. tuberkulin próba Az antigént szubkután juttatják be, ahol a helyi APC–k révén kerül bemutatásra A Th1 effektor sejtek felismerik az antigént és citokineket termelnek, melyek az endotél sejtekre hatnak Az antigén bejutási helyén látható duzzanat a fagocita sejtek és a plazma kiáramlása miatt képződik 24 – 72 óra korábbi immunizációból vissza- maradt effektor/memória T H 1 sejtek

72 Tuberkulin próba Tű beszúrása Ag bevitel Negatív reakció Pozitív reakció (induráció átmérője) Ag = antigén Pl. Mycobacterium fehérje (PPD)

73 A késői típusú hiperszenzitivitás (DTH) kémiai mediátorai A pozitív tuberkulin próba DTH reakció eredménye Kemokinek Makrofágok toborzása az antigén bejutásának helyére IFN γ Vaszkuláris adhéziós molekulák expressziójának növekedése, makrofágok aktivációja, inflammatorikus mediátorok kibocsátása TNF α és TNF β (LT) Lokális szövetkárosodás, adhéziós molekulák expressziójának növekedése IL-3/GMCSF Monocyta képződés a csontvelőben Antigén bemutatása szöveti makrofágok által, Th1 aktiváció

74 *általában a bőrön áthatoló kis molekula, amely saját fehérjékhez kötődik, így ezek módosulnak és az immunrendszer számára „idegenné” válnak Kontakt dermatitis Kontakt szenzitizáló anyag* hatására létrejött DTH A kontakt szenzitizáló anyag áthatol a bőrön és saját fehérjéhez kötődik, amelyet a Langerhans sejtek felvesznek A saját fehérjéhez kötött szenzitizáló ágenst a Langerhans sejtek bemutatják a Th1 sejteknek, amelyek IFNγ-t és más citokineket termelnek Az aktivált keratinocyták citokineket (IL-1, TNFα) és kemokineket (IL-8, IP-9 és MIG) szekretálnak A keratinocyták és Th1 sejtek által termelt faktorok aktiválják a makrofágokat, melyek gyulladásos mediátorokat termelnek (T sejt neoepitop)

75 Poison ivy – Mérgező borostyán v. Mérges szömörce Anacardiaceae (család), Toxicodendron (genus) Toxicodendron radicans or Rhus toxicodendron Kontakt szenzitizáló anyagot tartalmazó növény Amerikai növény (lásd az amerikai „orvosos” TV sorozatokban), de előbb utóbb be lesz hurcolva európába is

76

77 Catechol (reaktív haptén) Bőr fehérjéi Catechol bőrfehérjékhez kötve 7-10 nap 1-2 nap Primer szenzitizáció Második találkozás T memóriasejtek „gyors” aktivációja Gyulladásos reakció és dermatitis Szenzitizált T sejtek keletkezése és memóriasejtek kialakulása R = (CH 2 ) 14 CH 3 vagy R = (CH 2 ) 7 CH=CH(CH 2 ) 5 CH 3 vagy R = (CH 2 ) 7 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 2 CH 3 v. R = (CH 2 ) 7 CH=CHCH 2 CH=CHCH=CHCH 3 v. R = (CH 2 ) 7 CH=CHCH 2 CH=CHCH 2 CH=CH 2 stb. Catechol gyűrűs lipidek (Urushiolok): Kontakt szenzitizálás hatására (neoepitopok)

78

79 Cöliákia - lisztérzékenység emésztő- enzimek szöveti transz- glutamináz A glutén ellenálló fragmentumokra bomlik a bélben A szövetekbe jutott fragmentumokat a transzglutamináz deaminálja Naiv T-sejtek reagálnak a HLA-DQ által bemutatott deaminált peptidekkel Az effektor T-sejtek által indukált gyulladás a bolyhok atrófiájához vezet

80 T sejt válasz  MHC függés MHC heterogenitás  Nem minden személyben azonos módon/mértékben jelentkeznek a tünetek Más-más személy másként reagál különféle allergénekre/hiperszenzitivitást kiváltó anyagokra