1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA

Az előadások a következő témára: "1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA"— Előadás másolata:

1 1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA
2, EXPRESSZIÓS RENDSZEREK 3, FEHÉRJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK 4, IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László

2 GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA
Buday László

3 pl. teljes genomiális DNS vagy teljes cDNS adott szövetből
Teljes DNS kivonat: pl. teljes genomiális DNS vagy teljes cDNS adott szövetből Specifikus amplifikáció (DNS klónozás) Specifikus kimutatás Molekuláris hibridizáció PCR alapú in vitro DNS klónozás Sejt alapú klónozás 1. Jelzett DNS vagy RNS próba 2. Eljárás, mellyel kimu- tatjuk a próbát kötő géneket 1. Termostabil DNS Polimeráz 2. A klónozni kívánt DNS szakasz legalább részleges ismerete -- oligonukleotidok 1. megfelelő gazdasejt 2. vektor 3. A klónozni kívánt gén ligálása a vektorba, majd a gazdasejt transzfekciója

4 EGY GÉN PLAZMID VEKTORBA VALÓ KLÓNOZÁSÁNAK
ÁLTALÁNOS MENETE I. Molecular Cell Biology, Lodish, 1995 American Scientific Books

5 EGY GÉN PLAZMID VEKTORBA VALÓ KLÓNOZÁSÁNAK
ÁLTALÁNOS MENETE II. Molecular Cell Biology, Lodish, 1995 American Scientific Books

6 E. coli PLAZMIDOK HASZNÁLATÁNAK KORLÁTAI
1, Rövid DNS szakaszok befogadására alkalmasak (maguk a plazmidok 3-10 kb nagyságúak) 2, E. coli transzformációjának rossz hatásfoka (elektroporáció, hő-sokkolás, stb. – fizikális behatások) 3, Maximum néhány száz egyedi E. coli kolónia vizsgálható egy 10 cm-es petri csészében Ha pl. az emberi genomot (3 x 109 bp) szeretnénk E.coli-ban kifejezni, ez lehetetlen lenne. Megoldás másik vektor λ –bakteriofág használata

7 A LAMBDA-BAKTERIOFÁG SZERKEZETE
Molecular Cell Biology, Lodish, 1995 American Scientific Books Fertőzésnél a fág az E.coli felszínén található receptorhoz kötődik és a baktériumba lövi a DNS-ét.

8 A λ-FÁG SZERKEZETE II. (kb. 60 gént kódol) Fej Nyak Lítikus funkció Tetszőleges génre kicserélhető fág DNS darab (kb kb nagyságú gént lehet ide klónozni) Az itt kódolt gének nem nélkülözhetetlenek a fág-fertőzéshez

9 MIÉRT ELŐNYÖS TEHÁT A λ-FÁG A PLAZMIDDAL SZEMBEN?
1, Nagyobb DNS darabot lehet bele klónozni 2, Receptorhoz kötődve a baktérium felszínén kb. 1000x jobb hatásfokkal juttatja be a DNS-t az E.coli-ba, mint az plazmiddal történő transzformáció esetén történik Eukarióta sejtek genomját tipikusan olyan restrikciós enzimmel emésztik meg, mely 4-bázispár hosszú DNS szekvenciát ismer fel. Ilyen a Sau3A vagy MboI, melyek 44=256 bázispáronként hasítanak. Ezek a fragmentek túl kicsik lennének, ezért részleges emésztés történik, pl. alacsony enzim koncentrációval és rövid emésztési idővel. Így kb. 20 kb DNS fragmentek jönnek létre (ezek a fágba illeszthetőek).

10 HUMÁN GENOM: x 109 bp 20 kb (2 x 104 bp) 1,5 x 105 darab rekombináns fág Ezek összességét nevezzük GÉNKÖNYVTÁRNAK Sajnos a 1,5 x 105 db DNS-ben átfedő szekvenciák is vannak, ezért kb. 106 rekombináns fág szükséges ahhoz, hogy a teljes humán genom 90-95%-os valószínűséggel reprezentálva legyen.

11 A lambda-fággal való munka során nagyon kis méretű ún. plakkokat
lehet az E-coli réteget tartalmazó petri csészében felismerni: azaz egy petri csészében kb. 5 x 104 plakkot lehet vizsgálni Tehát petri csészében lehet a teljes emberi genomot vizsgálni Érdekesség: ha sikerülne a humán genomot recombináns plazmidban előállítani (106 db plazmid), akkor a genom vizsgálatához 5000 petri csésze kellene (kb. 200 E. coli kolóniát lehet egy petri csészén vizsgálni).

12 EGYÉB VEKTOROK A DNS maximális hossza, amit a vektorokba lehet klónozni. Vektor típusa DNS hossza (kb) Plazmid λ-bakteriofág Cosmid P1 bakteriofág vektor BAC (bacterial arteficial chromosome) max. 300 YAC (yeast arteficial chromosome)

13 cDNS KÖNYVTÁR -- míg egy állat vagy ember összes sejtmaggal rendelkező sejtje ugyanazzal a génállománnyal rendelkezik, addig a különböző tipusú sejtek, illetve szövetek eltérő fehérje-mintázatot expresszálnak -- pl. ALBUMIN-t csak májsejtek termelnek, így albumint kódoló mRNS csak májsejtekben szintetizálódik -- ha izoláljuk az adott sejttípusban megtalálható összes mRNS-t, majd ezekről REVERZ TRANSZKRIPTÁZ segítségével COMPLEMENTÁRIS DNS-t (cDNS) készítünk és az összes cDNS-t plazmidba vagy fágba klónozzuk, akkor ún. cDNS KÖNYVTÁRHOZ jutunk Fontos: a génkönyvtár azonos minden ember minden sejtmaggal rendelkező sejtjében (ezért gyakran vérsejtekből készítik), míg a cDNS könyvtár sejttől, szövettől függően eltérő!!!

14 cDNS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK MENETE
Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

15 EGY ADOTT GÉN KIVÁLASZTÁSA GÉN- VAGY cDNS KÖNYVTÁRBÓL
HIBRIDIZÁCIÓVAL TÖRTÉNIK Filterhez kötés Dupla szálú DNS DNS megolvasztása Jelölés jelzett DNS próbával Egyszálú DNS Nem kötődő DNS próbák kimosása Hibridizált DNS Autoradiográfia

16 HIBRIDIZÁCIÓS PRÓBÁK FAJTÁI
Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

17 A HIBRIDIZÁCIÓRA ALKALMAS PRÓBÁK JELÖLÉSE
Lehet: 1, Izotóppal jelölni (3H, 32P, 33P, 35S) 2, Nem izotópos jelölés a, fluoreszcens festékek b, biotin-straptavidin c, digoxigenin (specifikus ellenanyag van ellene) A JELÖLÉSE MÓDJA (in vitro) SZERINT LEHET: 1, DNS jelölés „nick” transzláció segítségével 2, DNS jelölés random primerek segítségével 3, Jelölés PCR segitségével 4, DNS végének jelölése

18 DNS JELÖLÉS RANDOM PRIMEREK SEGÍTSÉGÉVEL
Random primer: minden lehetséges variációja a hexanukleotidnak Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

19 EGY GÉN AZONONOSÍTÁSÁNAK ÁLTALÁNOS MENETE GÉN- VAGY
cDNS KÖNYVTÁRBÓL Molecular Cell Biology, Lodish, 1995 American Scientific Books

20 A NUKLEINSAVAK HIBRIDIZÁCIÓJÁNAK OPTIMALIZÁLÁSA
A hibridizáció hatásfoka függ: a denaturáló hőmérséklettől a só koncentrációtól (NaCl) a próba/nukleinsav aránytól a próba és DNS komplementaritásától Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

21 A HIBRIDIZÁCIÓ HŰSÉGE (HYBRIDIZATION STRINGENCY)
Ha csökkentjük a hibridizáció hőmérsékletét, illetve emeljük a a hibridizáció reakcióelegyében NaCl koncentrációját, akkor csökkentjük a hibridizáció hűségét: a próba és a kihalászott nukleinsav szekvenciája nem lesz teljesen komplementer ez nagyon fontos megfigyelés, mely alapja lehet homológ gének, illetve új géncsaládok azonosításának, klónozásának

22 ISMERT NUKLEINSAV HIBRIDIZÁCIÓS TECHNIKÁK
ELJÁRÁS NEVE A KIMUTATANDÓ NUKLEINSAV Dot-blot DNS, RNS minta, egy helyre felcsöppentve a membránra Southern-blot Gyakran genomiális DNS, gélelektoforézissel elválasztva, membránhoz kötve Northern-blot Teljes sejt-RNS vagy mRNS, gélelektroforézissel Koromoszóma Gyakran metafázisos kormoszómák (DNS), in situ hibridizáció tárgylemezen Szöveti in situ Tárgylemezen fixált sejtek RNS-e hibridizáció

23 REVERZ NUKLEINSAV HIBRIDIZÁCIÓS TECHNIKÁK
ELJÁRÁS NEVE A KIMUTATANDÓ NUKLEINSAV Reverz Dot-blot oligonukleotidok egy helyre felcsöppentve a membránon DNS microarray (DNS chip) DNS klónok robot segítségével rögzítve tárgylemezekre Oligonukleotid microarray oligonukleotidok robot segítségével rögzítve

24 SOUTHERN ÉS NORTHERN BLOT ELVE
Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

25 PÉLDA A NORTHERN-BLOT ELJÁRÁSRA
Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.