A szabályozó fehérjék szabályozása

Az előadások a következő témára: "A szabályozó fehérjék szabályozása"— Előadás másolata:

1 A szabályozó fehérjék szabályozása

2 A Rac kis G fehérje szabályozása
GAP Rac·GTP Rac·GDP GEF RhoGDI·Rac·GDP GAP = GTPáz aktiváló protein GEF = Guanin nukleotid kicserélő faktor GDI = Guanin nukleotid disszociáció inhibitor

3 A kis GTPázok alcsaládjai és szabályozó fehérjéi
RAS RHO RAB ARF RAN H-Ras Rho-A Rab ARF1- Ran K-Ras Rho-B Rab ARF7 N-Ras Rho-C Rap Rac1 Rap Rac2 Ral Cdc42 GAPok GEFek Rho-GDI Rab-GDI

4 Mi újság a GEF-ek körül?

5 A DH-GEFek domén szerkezete
(Zheng, 2001)

6 GEF-ek GTPázok Target fehérjék

7 GEF-ek GTPázok Target fehérjék

8 GEF-ek GTPázok Target fehérjék

9 GEF-ek GTPázok Target fehérjék

10 PROBLÉMA: Hol a specificitás?
GEF-ek GTPázok Target fehérjék PROBLÉMA: Hol a specificitás?

11 Specificitás pedig van:
Patel et al. 2002, MBC, 13.,

12 MEGOLDÁS: fehérje komplexek
GEF-ek GTPázok Target fehérjék MEGOLDÁS: fehérje komplexek

13 1. példa RGS PH/DH p115RhoGEF

14 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho

15 CNK1 target/scaffold fehérje
RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK target/scaffold fehérje Jaffe A.B. et al. MCB ; Cur. Biol ;

16 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK target/scaffold fehérje MLK2 kináz

17 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK target/scaffold fehérje MLK2 kináz Jun → Jun-P

18 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P

19 Gα12 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P

20 LPA-R Plazmamembrán Gα12 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P

21 LPA-R Plazmamembrán Gα12 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P

22 LPA-R Plazmamembrán Gα12 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P Kísérleti tény: CNK1 hiány: LPA-indukált jun-P hiányzik, de stressz-rost képzés változatlan CNK1 túltermelés: (GEF/Rho63 indukált) jun-P ↑ stressz-rost képzés ↓ (Rho megkötése)

23 2. példa Tiam-1 Rac Conolly BA et al., MCB

24 2. példa Tiam-1 Rac IBS/JIP2 IRSp53 siderophilin

25 2. példa Tiam-1 Rac IBS/JIP2 IRSp53 siderophilin WAVE 2 p38 MAP kináz
Aktin citoszkeleton p38 MAP kináz p70 S6 kináz

26 2. példa Tiam-1 Rac IBS/JIP2 IRSp53 siderophilin WAVE2 p38 MAP kináz
Aktin citoszkeleton p38 MAP kináz p70 S6 kináz

27 Cdc42 IRSp53 Mena filopódium képzés

28 DH/PH Tiam-1 Rac Cdc42 IRSp53

29 DH/PH Tiam-1 Rac Cdc42 IRSp53

30 DH/PH Tiam-1 Rac IRSp53 WAVE2 lamellipodium képzés

31 PDGF-R Ras DH/PH Tiam-1 Rac IRSp53 WAVE2 lamellipodium képzés

32 PDGF-R Ras DH/PH Tiam-1 Rac IRSp53 WAVE2 Kísérleti tény: IRSp53 hiányban PDGF-R indukált lamellipódium képzés ↓ lamellipodium képzés

33 3. példa Cool-2/α-Pix (Cloned out of library 2)
(PAK-interactive exchange factor) Feng et al., EMBO J ; Baird et al., Curr. Biol

34 Cool-2/α-Pix dimér mint Rac-GEF
Cdc42 → Rac aktiválás mechanizmusa

35 Cool-2/α-Pix monomer mint Cdc42-GEF
Gβγ + PAK kötődés

36 Cool-2/α-Pix monomer mint Cdc42-GEF
Gβγ + PAK kötődés GEF-smg-target komplex

37 Gondolatok: G-fehérje kaszkádok Gα12 → p115RhoGEF → Rho
Ras → Tiam-1 → Rac Cdc42 → Cool-2/α-Pix → Rac 2. smg kezd „beágyazódni” (up-stream, down-stream kapcsolatok)

38 GAPok

39 Rho/Rac GAPok doménszerkezete
TiCB

40 Lipidek részvétele GAP-ok szabályozásában
Chimaerin Rac PMA, DAG, stb. ↑ / ↓ ASAP1 ARF1, ARF5 PIP2 ↑ GIT ARF6 PIP ↑ ARAP1 ARF1, ARF5 PIP ↑ Rho = ARAP3 ARF6 PIP3 ↑ Brown et al. MCB ; Vitale et al. JBC ; Miura et al. Mol. Cell ; Krugmann et al. Mol. Cell

41 A PL szerkezet hatása az ARF-GAP1 aktivitására
Antonny B. et al. JBC

42 A vezikulaméret hatása az ArfGAP1 aktivitására
Bigay J. et al. Nature

43 Az ARF-GAP1 szabályozásának modellje
Bigay et al. Nature

44 Az ARFGAP és ARFGEF lipid érzékenysége
Antonny B. et al. JBC

45 Antonny B. et al. JBC

46 A p190RhoGAP domén szerkezete
Src PKC GTPáz 4 x FF GAP

47 PS hatása az endogén GTPáz aktivitásra
Rac Rho Ligeti et al. JBC 2004.

48 PS hatása p190 Rho-GAP és Rac-GAP aktivitására
Bound 32P-GTP (%) Bound 32P-GTP (%) p190GAP relatív menyisége Ligeti et al. JBC 2004.

49 A kísérletek kontrollja
[32P]GTP fogyás alapján [32P]foszfát keletkezés alapján Ligeti et al. JBC 2004.

50 PS és SDS hatása a p190 Rho- és RacGAP activitására
Ligeti et al. JBC 2004.

51 Különböző PL-k hatása a p190 GAP activitására
Rac Rho Ligeti et al. JBC 2004.

52 A PKC hatása a p190 Rho- and RacGAP activitására
ATP jelen ATP nélkül

53 P190 kísérletek újdonsága:
GAP fehérje módosítása változtatja a szubsztrát specificitást Hasonló helyzet: MgcRacGAP → nem-foszforilált állapotban Rac/Cdc42-GAP foszforiláció után: Rho-GAP is Minoshima et al. Dev. Cell

54 További példák GAP-szabályozásra
Autoinhibició: p50GAP – nyitja: smg prenil csoportja RA-RhoGAP – nyitja: RapGTP kapcsolódás funkció: neurit növekedésben

55 GAP hatástól független funkciók:
p190GAP FF-domén TFII-I köt, citoszolba lokalizálja azt FF-domén Tyr-foszforiláció → TFII-I elengedés → magba vándorol Tumbleweed (RacGAP50C) (Droso) axon növekedés – GAP hatás függő citokinesis – GAP hatástól független p50GAP Sec14 domén lokalizálja, Sec14 mutáció – de nem GAP domén mutáció – biológiai hatása

56 p50GAP eloszlása és biológiai hatása a Sec14 doménhoz kötött
Sirokmány et al JBC

57 Rho-GDI

58

59 RacGDP RhoGDI RhoGDP

60 RacGDP → RacGTP X P - RhoGDI RhoGDP PAK

61 X RacGDP → RacGTP P - RhoGDI RhoGDP PAK Cdc42 / Rac
DerMardirossian C. et al. Mol. Cell

62 Gondolatok: G-fehérje kaszkádok Gα12 → p115RhoGEF → Rho
Ras → Tiam-1 → Rac Cdc42 → Cool-2/α-Pix → Rac Cdc42→ PAK → RhoGDI→ Rac Rap → RA-RhoGAP → Rho↓ 2. smg kezd „beágyazódni” (up-stream, down-stream kapcsolatok)

63 Bernards A. and Settleman J.
IRODALOM Bernards A. GAPs galore! A survey of putative Ras superfamily GTPase activating proteins in man and Drosophila BBA Bernards A. and Settleman J. GAP control: regulating the regulators of small GTPases Trends Cell Biol