Orálbiológiai Tanszék, Semmelweis Egyetem Budapest

Az előadások a következő témára: "Orálbiológiai Tanszék, Semmelweis Egyetem Budapest"— Előadás másolata:

1 Orálbiológiai Tanszék, Semmelweis Egyetem Budapest
Molekuláris diagnosztika - Általános és orális patofiziológia szeminárium Dr. Varga Gábor Orálbiológiai Tanszék, Semmelweis Egyetem Budapest 2010

2

3

4 Példák a molekuláris diagnosztika eszközrendszerének alkalmazására
Cysticus fibrosis Osteogenesis imperfecta Dentinogenesis imperfecta Amelogenesis imperfecta Hypohidrotikus ectodermalis dysplasia A szájüregi-nyaki régió daganatai Génterápia Human genom projekt

5 A genetika, a genomika és a génterápia orális/dentális alkalmazásának néhány kézenfekvő területe
• A fogfejlődés genetikai betegségei • A fej-nyak régió rákos betegségei • Caries képződés és fogerózió prevenciója • Csontdefektusok korrekciója • Krónikus fájdalom csökkentése • Parodontális gyulladás kezelése • Nyálmirigyek csökkent működésének gyógyítása • Szisztémás betegségek kezelése nyálmirigyek génterápiájával

6 Az örökítőanyag Sejtjeink valamennyi életműködése az örökítőanyagukban tárolt program szerint játszódik le. Az örökítőanyag a sejtmagban lévő kromoszómákban található. A kromoszómák legfontosabb alkotórésze a DNS. kromoszóma sejtmag sejt

7 A DNS replikációja A szekvencia a DNS-molekulák replikációja során adódik tovább. A DNS-molekulák replikációja szemikonzervatív: az egyik szál változatlanul továbbadódva templátként szolgál az újonnan készülő szál szintéziséhez.

8 A gének A DNS-nek azt a szakaszát, amely egy adott tulajdonságunkat határozza meg, génnek nevezzük. egyik gén másik gén Kromoszóma DNS

9 Hogyan működik egy gén? fehérje
A sejtmagban a génről a transzkripció során egy ún. RNS átirat készül. Ezt hírvivő RNS-nek nevezzük. A hírvivő RNS (mRNS) a sejtmagból kijutva a riboszómához kerül. A riboszómán készül el a transzláció folyamán az átirat alapján a fehérje. Az információ iránya tehát: DNS  RNS  fehérje SEJTMAG DNS gén hírvivő RNS maghártya mRNS riboszóma fehérje fehérje

10 Az aminosavak genetikai kódja –
bázishármas

11 Az aminosavak genetikai kódja

12 Molekuláris diagnosztikai módszerek
Southern blot (polinukleotid hibridizáció) Northern blot (polinukleotid hibridizáció) Western blot (specifikus ellenanyagkötődés) Polimeráz láncreakció (PCR) (gyakran reverz transzkripció után) (oligonukleotid hibridizáció) DNA szekvenálás (nucleotid szintézis/lebontás követése specifikusan festődő nucleotidokkal) DNA array - DNA chip technológia (polinukleotid hibridizáció)

13 A reverz transzkripció
Reverz transzkripcióhoz RNS-vírusokból (pl. M-MLV = Moloney egér leukémia vírus) izolált RNS-dependens DNS-polimerázokat, ún. reverz transzkriptázokat alkalmazunk. A reverz transzkriptázok ribonukleotid egységek egyszálú DNS-be épülését katalizálják templátfüggő módon. Templátjuk az RNS. A reverz transzkriptázoknak is szükségük van primerre. Lehetséges primerek: random hexamerek, oligo(dT)12–18, génspecifikus anti-sense primer.

14 AZ “ÉGTÁJAK” Southern blot – A DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük
– A kapott fragmentumokat gélelektroforézissel méret szerint elválasztjuk – A gélt lúgban áztatjuk, hogy a DNS denatu-rálódjon, majd az egészet savval semlegesítjük – blottolás nitrocellulóz membránra – jelölés radioaktív DNS-sel • Northern blot – RNS blottolása, majd jelölés radioaktív DNS vagy RNS-el • Western blot – Fehérje blottolása, majd jelölés radioaktívan vagy enzimatikusan jelölt antitesttel

15 SOUTHERN BLOT

16 NORTHERN BLOT: AZ RNS RNS = ribonukleinsav
a citoplazmában és a sejtmagban is megtalálható építőelemei: • bázisok (A,G, C, U) • ribóz • foszfát csoport • egyszálú, de ez nem jelenti azt, hogy egyenes is

17 TOTÁL RNS IZOLÁLÁSA • pl. a fagyasztott szöveteket mozsárban folyékony nitrogén alatt porrá törjük. Fehérje DNS CsCl RNS – fenol/kloroformos extrakcióval – ultracenrifugálással (UC) – kicsapás LiCl-dal vagy alkohollal – Kit-ek segítségével • Spektrofotometriás méréssel a 260 nm-en mért OD-ből az RNS oldat koncentrációja az alábbiak szerint számolható: Konc (µg/µl) = OD260 x 40RNS x oldási faktor 1000

18 GÉLELEKTROFORÉZIS A foszfát csoportok miatt negatív töltéssel rendelkező RNS molekulák a negatív pólustól a pozitív pólus felé vándorolnak. A nagyobb molekulák lassabban, míg a kisebbek gyorsabban vándorolnak a gél pórusai között és ezért távolabb kerülnek a kiindulási ponttól. Az RNS minták felvitele a zsebbe formaldehidet tartalmazó denaturáló gél futtató kád puffer A vándorlás iránya Pozitív (+) elektród Negatív (-) elektród

19 GÉLELEKTROFORÉZIS II Tehát az elválasztás a méret szerint történik.
De előfordulhat, hogy úgynevezett hajtű formák jönnek létre. Ekkor viszont a molekulatömeg egyezése mellett is a méretek különbözőek lesznek. A B szerkezetű molekula gyorsabban fog haladni a gélben, mint az A. Ezt elkerülendő denaturáló körülményeket alkalmaznak, vagyis formaldehidet a gélben és a RNS felviteléhez alkalmazott úgynevezett mix oldatban. A B bázis-párosodott régió

20 KAPILLÁRIS BLOTTOLÁS 0.5 kg membrán gél A transzfer iránya
száraz papírtörülközők üveglap Kád 20xSSC pufferrel 3MM filter membrán gél

21 HIBRIDIZÁCIÓ • A hibridizálás során a komplementaritás elvét használjuk fel. Lényege: szekvencia- vagy alak-specifikus felismerés, mely két molekula egymáshoz kötődésekor jön létre – pl. egy DNS dupla-helix két szála kötődik egymáshoz, mert komplementerek • Ugyanez az elv valósul meg egy szonda (próba) molekula és egy “cél “molekula között, melyek egy komplexet alkotnak. • Ez a komplex lokalizálható, ha a szonda radioaktívan vagy enzimatikusan jelölve volt. A komplex lokalizációja pedig információval szolgálhat a “cél” molekuláról.

22 JELÖLÉS kettévált szálak kétszálú templát DNS cukor-foszfát váz
bázispárok kettévált szálak denaturálás 5`, 95°C hexamerek vagy oligo(dT) hozzáadása bázispárosodott hexamerek puffer nukleotidok 32P-dCTP Klenow pl. új, radioaktív DNS jég, tisztítás Nick column Sephadex 50 radioaktív szonda denaturálás

23 HIBRIDIZÁCIÓ III 10 ml 20 ml 30 ml UV-vel irreverzibilisen a membrán felületéhez kötjük az RNS-eket éjszakán át 42°C-on + = Egy sok komponensből álló hibridizáló oldatban a membránt előinkubáljuk, majd a szonda hozzáadása után hibridizáltatjuk

24 WESTERN BLOT DNS  fehérje
Fontos tudni a DNS transzkripció és mRNS transzláció folyamatát A fehérjék komplex molekulák, különbözhetnek méretben, töltésben, alakban (elsődleges, másodlagos, harmadlagos és negyedleges szerkezet), funkcióban és szekvenciában. Ami viszont mindegyikre igaz, hogy az aminosav szekvencia egyenes, nem alágazó. Érdekelhet bennünket egy fehérje olyan szempontból, hogy milyen gyógyszerhatással rendelkezik vagy megismerésével egy metabolikus folyamat jobban érthetőbbé válhat. Az eltérő célok eltérő fehérjetisztítási és eltérő fehérje kimutatási módok kidolgozását hívták életre.

25 WESTERN BLOT II Minta preparálás: Kisebb nagyobb eltérésekkel ugyanaz a módszer alkalmazható sejtekből és/vagy szövetekből történő izolálás esetén. Mindegyiknél fontos, hogy: * jégen legyenek a minták, * proteáz inhibítor koktélt alkalmazzunk, * tiszta, szennyeződésmentes eszközöket alkalmazzunk, * gyorsan kell dolgozni! Koncentrációmérés: * abszorpciós mérés 280 nm-en UV-ban (DNS tartalom bezavarhat) * Bradford kolorimetriás mérés nm-en specifikus, a funkcionális egységgel reagáló festék hozzáadását követően. Pl. Coomassie Brilliant Blue G-250 festék a bázikus és aromás aminosav részhez, pl. arginin-hez kötődik.

26 WESTERN BLOT III Natív elektroforézis: az elválasztás alapja a fehérjék eltérő töltése, mely jellemző egy adott pH-n. Sok lizin = erősen pozitív töltés, sok aszparaginsav rész = erősen negatív töltés Ennek megfelelően valamelyik a pozitív, valamelyik a negatív pólus felé fog vándorolni. Denaturáló PAGE = poli (30% acrilamid:bisakrilamid) gélelektroforézis minden fehérje rendelkezik hidrofób részekkel, ami képes detergens anyagokhoz kötődni, mint pl. a nátrium dodecyl szulfáthoz (SDS). Ezáltal válik minden fehérje negatívvá és ez egyenesen arányos a fehérje tömegével, tehát az elválasztást továbbiakban csak a méret fogja meghatározni.

27 WESTERN BLOT IV Kétféle pufferrendszert használnak:
összefüggő: egyféle szeparáló gél van és ugyanaz a puffer a gélben és a tankban nem összefüggő: a szeparáló vagy “running” gél felett egy nem-korlátozó, nagy pórusú (~4%) “stacking” gél is található. (feszültség)*(töltés) (súrlódás a molekulán) A gélben a mobilitás=  1/molekulatömeg MERT: az SDS minden molekula körül a méretének (tömeg) megfelelő negatív töltést hoz létre, egy futtatás során az alkalmazott feszültség minden minta esetén azonos. Dithiothreitol (DTT) vagy 2-merkaptoetanol segítségével felbontjuk a cisztein részek közötti szulfidhidakat. SDS és DTT együttesen neutralizálja a fehérjék alakját.

28 - + WESTERN BLOT V Stacking gél
Nagyon fontos kiválasztani az adott fehérje elválasztásához legmegfelelőbb %-os gélt. Running gél +

29 WESTERN BLOT VI Kimutatás a futtatás után:
festéssel (pl. Coomassie Brilliant Blue (R-250, G-250), Amido Black 10B, Serva Violet, and Fast Green FCF). Az eltérő festékek eltérő kimutathatósági határral rendelkeznek. Ezt követi minden esetben egy metanol:ecetsavban történő áztatás, ami a gélmátrixból eltünteti a festéket, és végeredményben csak a fehérjéhez kötött festékcsíkok fognak látszódni.

30 WESTERN BLOT VII Blottolás:
célja, hogy a méret szerint elválasztott fehérjéket szilárd felületre, ált. nitrocellulóz vagy PVDF (polyvinylidene difluoride) membrán felületére vigyük át. Ez általában elektromos áram segítségével törté-nik, de a hagyományos kapilláris blottolással is megoldható. Blokkolás: BSA vagy zsírszegény tejporral

31 WESTERN BLOT VIII Detektálás:
direkt: specifikus antitestekkel, mely az általunk érdekes fehérje epitóp ellen lett termeltetve. Az antitest vagy fluoreszcens festékhez (UV-ban deteltálható) vagy valamilyen enzimhez (tormaperoxidáz=HRP) van kötve. Ez utóbbi chemilumineszcens reakciót idéz elő, vagyis kémiai reakcióban fény keletkezik, ami azután röntgen filmen rögzíthető.

32 A polimeráz láncreakció (PCR)
Mit tud? – A PCR arra alkalmas, hogy DNS-molekulák komplex elegyéből egy általunk kiválasztott tetszőleges DNS szakaszt specifikusan felsokszorozzunk. Mire jó ez nekünk? – Példák a PCR alkalmazási területeire: leukémiákban, limfómákban kromoszóma-transzlokációk, kórokozók, monoklonalitás kimutatása igazságügy (VNTR PCR: gyilkosság, nemi erőszak, apasági perek) Hogyan lehetséges ez? – A PCR a DNS replikáció, ill. a DNS-polimerázok néhány sajátosságát használja ki.

33 PCR folyamatábra Ami egy PCR-hez kell
puffer (10 mM TrisHCl pH 8,3–9,0; 50 mM KCl; 0,01% Triton X-100) templát DNS (kb. 0,5 g) primer (0,1–0,6 M) DNS-polimeráz (0,5–2,5 U / 50 l) Mg2+ (1–5 (általában 1,5) mM) dNTP (50–500 (általában 200) M egyenként) egyéb adalékok nukleázmentes körülmények PCR készülék (programozható termosztát) denaturálás: 94–96 °C primerek kötődése: 50–65 °C DNS szintézis: 72 °C Animáció:

34 A PCR-ben használt DNS-polimerázok
Eleinte E. coli DNS-polimeráz I-et használtak PCR-hez, ám ez a templát denaturálására alkalmazott hőmérséklen inaktiválódik, ezért minden ciklusban új alikvotot kellett a reakcióelegyhez adni. Később termofil ősbaktériumok (Thermus aquaticus, - thermophilus, Pyrococcus furiosus, - woesei) hőstabil DNS-polimerázait kezdték alkalmazni. Hőstabil polimerázok tulajdonságai:

35 A PCR termociklus I. Denaturáció (96oC) I. III. II.
dsDNS  ssDNS II. III. t t II. Annelálás (40-60oC) a primerek a komplementer szekvenciákhoz kapcsolódnak III.polimerizáció (72oC) DNS replikáció hőstabil DNS polimerázzal

36 SNP (egypontos nukleotid variáció, single nucleotide polymorphism)
4,3 millió beküldött SNP 2,7 millió ref SNP (humán) 2002. május

37 Mutációk adatbázisa:

38 SNP-k és pontmutációk vizsgálata
Alapelv: a különböző variánsok hossza nem különbözik, csak a bázissorrend tér el (egyetlen helyen) a szekvenciabeli eltérést hosszkülönbséggé kell alakítani Egyszálú konformációs polimorfizmus (SSCP) vizsgált (rövid) régió megsokszorozása PCR-rel denaturáló akrilamid gél-elektroforézis: ssDNS konformációja  mobilitása az egy bázis eltérés miatt kissé különböző

39 Restrikciós fragmentumok hosszúság(lenght) polimorfizmusa
PCR- RFLP Restrikciós fragmentumok hosszúság(lenght) polimorfizmusa példa: DRD4 promoter –521CT SNP 1. vizsgált régió megsokszorozása: PCR –521CT 2. restrikciós emésztés: II. típusú restrikciós endonukleázok: 6–8 bp-os palindrom szekvenciát ismernek föl hasítási hely

40 DRD4 promoter –521CT SNP GTCCGGTCCC GGGACCCCCT GCCCAGGGTC AGAGGGGCGC CTACCTAGCT CACGGTCTTG GGCCGGAGGG AATGGAGGAG GGAGCGGGGT CGACCGCTCA GCTGTCCGCC CAGTTTCGGA GGCGGCCACG CGAGGATCAA CTGTGCAACG GGTGGGGCCG CGGCTGACCG TGGTGGTCGC GGGGGCTGAG GGCCAGAGGC TGCGGGGGGG GGGCGGCGGG ATGAGCTAGG CGTCGGCGGT TGAGTCGGGC GCGGAGTCGG GGGCAGGGGG AGCGGGCGTG GAGGGCGCGC ACGAGGTCGA GGCGAGTCCG CGGGGGAGGC GGGCAGAGCC TGAGCTCAGG TCTTTCTGCG TCTGGCGGAA CGGGCCTGGG AGGGAGGTTT TGCCAGATAC CAGGTGGACT AGGGTGAGCG CCCGAGGGCC GGGACGCACG CACGGGCCGG GTAGGATGGC GCTGGCGTCG ATGCCCGCGC GCTTCAGGGC CTGGTCTGGC CGCCCCTCCA TCCTTGTCGG TTTCTCGGGT CGCGGACCCC GCGCGGCGCC GGGCGATGCT GGCCTGCCCG TGGCCACCAC CTCGCTTCAT TCCCGTCTCT TTGGGCCGCC GCATTCGTCC ACGTGCCCGT CTCTCCCTGC GCAAAATTCC AAGATGAGCA AATACTGGGC TCACGGTGGA GCGCCGCGGG GGCCCCCCTG AGCCGGGGCG GGTCGGGGGC GGGACCAGGG TCCGGCCGGG GCGTGCCCGA GGGGAGGGAC TCCCCGGCTT GCGACCCGGC GTTGTCCGCG –521CT SNP

41 SNP-k vizsgálata: (RFLP)
DRD4 promoter –521CT SNP GTCCGGTCCC GGGACCCCCT GCCCAGGGTC AGAGGGGCGC CTACCTAGCT CACGGTCTTG GGCCGGAGGG AATGGAGGAG GGAGCGGGGT CGACCGCTCA GCTGTCCGCC CAGTTTCGGA GGCGGCCACG CGAGGATCAA CTGTGCAACG GGTGGGGCCG CGGCTGACCG TGGTGGTCGC GGGGGCTGAG GGCCAGAGGC TGCGGGGGGG GGGCGGCGGG ATGAGCTAGG CGTCGGCGGT TGAGTCGGGC GCGGAGTCGG GGGCAGGGGG AGCGGGCGTG GAGGGCGCGC ACGAGGTCGA GGCGAGTCCG CGGGGGAGGC GGGCAGAGCC TGAGCTCAGG TCTTTCTGCG TCTGGCGGAA CGGGCCTGGG AGGGAGGTTT TGCCAGATAC CAGGTGGACT AGGGTGAGCG CCCGAGGGCC GGGACGCACG CACGGGCCGG GTAGGATGGC GCTGGCGTCG ATGCCCGCGC GCTTCAGGGC CTGGTCTGGC CGCCCCTCCA TCCTTGTCGG TTTCTCGGGT CGCGGACCCC GCGCGGCGCC GGGCGATGCT GGCCTGCCCG TGGCCACCAC CTCGCTTCAT TCCCGTCTCT TTGGGCCGCC GCATTCGTCC ACGTGCCCGT CTCTCCCTGC GCAAAATTCC AAGATGAGCA AATACTGGGC TCACGGTGGA GCGCCGCGGG GGCCCCCCTG AGCCGGGGCG GGTCGGGGGC GGGACCAGGG TCCGGCCGGG GCGTGCCCGA GGGGAGGGAC TCCCCGGCTT GCGACCCGGC GTTGTCCGCG –521CT SNP Fsp I Fsp I

42 SNP-k vizsgálata: (Fsp I-RFLP)
DRD4 promoter –521CT SNP –521CT nem polimorf 1. PCR 605 bp –521T –521C TGTGCA CGCGCA 2. RFLP Fsp I enzim 560 bp 45 bp 342 bp 218 bp 560 bp 218 bp 342 bp TT CT CC

43 Az RT-PCR specifitása A PCR optimalizálásakor ugyanazokra a szempontokra kell figyelni, mint genomi DNS-ből kiinduló PCR esetén. További probléma: A sejtekből, szövetekből izolált RNS általában genomi DNS-sel szennyezett. Honnan tudjuk, hogy amennyiben megkaptunk egy génre jellemző PCR-terméket, az valóban az átíródó gén mRNS-éből kapott termék, vagy a genomi DNS-szennyeződést amplifikáltuk? Lehetséges megoldások: Tiszta RNS-t preparálunk (CsCl, ultracentrifuga). DNázzal emésztjük az RNS-mintáinkat. Olyan primereket tervezünk, melyek két különböző exonon helyezkednek el (így a genomi DNS-ből amplifikált termék hosszabb lesz).

44 Módszertani áttörések
1992-es adatok a DNS szekvenálásról: 1$/bp, 100,000 bp/év Humán genom 3x109bp: 30,000 év, 3 milliárd dollár (?) Módszertani áttörések Automata DNS szekvenálás kifejlesztése Polimeráz láncreakció (PCR) Adatfeldolgozás fejlődése (Bioinformatika)

45 Az automata DNS szekvenálás elve
‘Színes szekvenálás` A di-deoxi lánctermináláson alapul Termináló helyek ... 3’ C A G T A ddA Szekvenáló reakcióelegy: Mind a négy dNTP Mind a négy ddNTP különböző színű fluorogén festékkel DNA polimeráz, primer

46 Egy szekvenálási eredmény:
+ index

47 DNS chip technológia

48 A hibridizáció alapelve
„Kihorgásszuk” a keresett génterméket, azaz RNS-t. Itt a „csalit” úgy hívják, hogy szonda (próba). Ez egy DNS- vagy RNS-darab, amely megegyezik a vizsgált gén egy szakaszával. A keresett RNS a „hal”, amire horgászunk. A hal megtalálja a csalit, azaz a próba és a keresett géntermék felismeri egymást komplementer bázisaik párosodása révén.

49 A próbák szabályos rendben helyezkednek el egymás után, mint a parton a horgászbotok.
kishal a csukának kukorica a pontynak kukac a keszegnek

50 Az RNS-ek között mindenféle van.

51 Ha közülük valamelyiket egy próba fölismeri, az “horogra akad”.
csuka ponty keszeg

52 Ha a halainkat megjelöljük, akkor láthatók lesznek.
csuka ponty keszeg

53 Amelyik hal nem akadt horogra, az elúszik.
csuka ponty keszeg

54 Amelyik hal nem akadt horogra, az elúszik.
csuka ponty keszeg

55 A horgászbotok a valóságban
A macroarray olyan nejlon membrán, amelyen meghatározott mintázatban felvitt cDNS klónok találhatók. A klónok azonosítása a filteren lévő pozíciójuk alapján lehetséges. egyik klón másik klón

56 Példa: Génexpressziós változások komplex vizsgálata
Panc-1 adenokarcinóma sejteket 24 órán át inkubáltunk tápfolyadékban, ill. 100 nM forbol 12-mirisztát 13-acetát (PKC aktivátor) jelenlétében. A sejtekből teljes RNS-t izoláltunk, majd a kontroll, ill. a kezelt sejtek RNS-éről radioaktív reverz transzkripciós reakcióban jelölt komplex próbát szintetizáltunk. A jelölt próbákat két, egymással megegyező macroarray membránra hibridizáltuk. kontroll kezelt

57 Northern Array RNA samples RNA sample sample 1 labeled complex probe
denature RNA RNA sample sample 1 isolate RNA radioactive labeling labeled complex probe hybridize to macroarray with immobilized clones sample 2 compare

58 cDNS-chip expressziós microarray
készítés

59 cDNS-chip expressziós microarray: két-szín hibridizáció

60 cDNS-chip expressziós microarray: leolvasás: két-szín hibridizáció

61 Példák a molekuláris diagnosztika eszközrendszerének alkalmazására
Cysticus fibrosis Osteogenesis imperfecta Dentinogenesis imperfecta Amelogenesis imperfecta Hypohidrotikus ectodermalis dysplasia A szájüregi-nyaki régió daganatai Génterápia Human genom projekt

62 A cysticus fibrosis kórtana
Ionvezetési defektus Csökkent folyadékszintek Túlkoncentrált szekrétumok Nyál-mirigyek csökkent működése Obstruktív tubulopátia Pancreas: Exokrin hiány Endokrin hiány Pancreatitis Reproduktív: Ffi meddőség Figure 9-5. Pathophysiology of cystic fibrosis. The ion conductance defect in epithelial tissues almost always results in reduced fluid flow within epithelia of organs normally possessing cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) expression. Absent or dysfunctional CFTR would be expected to lead to functional consequences in organs with a high concentration of macromolecules in the lumen of the ducts. A variety of organs listed in this figure are affected pathologically when proteins or other macromolecules precipitate, form plugs, slow ductal flow, and lead to blockage. (Adapted from Forstner and Durie [].) Tüdő: Eltömődés Fertőzés Gyulladás Bélrendszer: Meconium ileus Distalis béli elzáródás szindróma Máj: Epecirrhosis Epekövek Epesár

63 Epithelialis ion transzport - egészséges
Figure 9-3. Epithelial cell transport. A, Apical chloride channels are important elements in the secretion of sodium chloride by epithelial cells. In a typical epithelial cell, basolateral membrane transport processes give rise to accumulation of chloride intracellularly to levels that exceed the electrochemical potential in the cell exterior. When the apical chloride channel opens, the electrochemical gradient allows chloride to exit through the apical membrane. This generates a lumen-negative voltage that stimulates exit of sodium through paracellular-tight junctions. Secretion of water follows the movement of sodium and chloride. B, In cystic fibrosis, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channel is absent or defective. Consequently, chloride efflux from the apical membrane is impaired, which in turn prevents the movements of sodium paracellularly. The net effect of defective apical chloride channels would lead to diminished secretory volume. Na+—sodium; Cl-—chloride; K+—potassium; P—paracellular route; T—tight junction. The circles in the basolateral membrane denote coupled ion transporters. (Adapted from Forstner and Durie [].)

64 Epithelialis sejt transzport - CF
Figure 9-3. Epithelial cell transport. A, Apical chloride channels are important elements in the secretion of sodium chloride by epithelial cells. In a typical epithelial cell, basolateral membrane transport processes give rise to accumulation of chloride intracellularly to levels that exceed the electrochemical potential in the cell exterior. When the apical chloride channel opens, the electrochemical gradient allows chloride to exit through the apical membrane. This generates a lumen-negative voltage that stimulates exit of sodium through paracellular-tight junctions. Secretion of water follows the movement of sodium and chloride. B, In cystic fibrosis, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channel is absent or defective. Consequently, chloride efflux from the apical membrane is impaired, which in turn prevents the movements of sodium paracellularly. The net effect of defective apical chloride channels would lead to diminished secretory volume. Na+—sodium; Cl-—chloride; K+—potassium; P—paracellular route; T—tight junction. The circles in the basolateral membrane denote coupled ion transporters. (Adapted from Forstner and Durie [].)

65 Cysticus fibrosisos pancreas szövettani képe
Figure Histologic section of a pancreas from a patient with cystic fibrosis. Pancreatic damage begins in utero with accumulation of proteinaceous secretory material within small pancreatic ducts []. The obstructive process causes dilatation of the duct lumina, which is followed by progressive degradation and atrophy of the acini. In patients with pancreatic insufficiency, advanced acinar destruction is present by the first few years of life and exocrine glands become replaced by fibrous tissue and fat. Initially, endocrine tissue is relatively preserved but as patients grow older islet cells are lost and the glands become completely replaced with fibrous tissue. Pancreatic calcification and cystic changes are occasionally seen in older patients.

66 A cysticus fibrosis gén azonosítása
Figure 9-1. A-C, Identification of the cystic fibrosis (CF) gene. In 1989, following concerted efforts by various investigators throughout the world, the CF gene was identified by Lap-Chee Tsui and J. Riordan of the University of Toronto, in collaboration with Francis Collins of the University of Michigan []. The CF gene, which is on the long arm of chromosome 7, comprises 27 exons spanning 230 kb of DNA. The gene product (initially thought to be comprised of 24 exons), named the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, (CFTR), is a protein of 1480 amino acids. The predominant mutation, which accounts for approximately 70% of all the CFTR gene mutations worldwide, is a three base-pair deletion in exon 10 of the CFTR gene, which results in the loss of a single amino acid, phenylalanine, at codon 508 (ΔF508). (Adapted from Tsui [].)

67 N-kapcsolt szénhidrátok
A cysticus fibrosis transzmembrán konduktancia regulátor aminosav-szekvenciájának megismerésével következtethetünk rá, hogy a fehérje membráncsatornaként működik Figure 9-2. The deduced primary amino acid sequence of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) immediately suggested that the gene product was a membrane channel. This schematic model of the CFTR protein, which is situated within the cell membrane, shows membrane-spanning helices on each half of the molecule, which is shown as cylinders. The green spheres show two nucleotide binding folds (NBF); the light blue sphere shows large polar regulatory domain (R domain). Individual charged amino acids within the R domain are shown. Potential phosphorylation sites and N-glycosylation linkages are as shown. The predicted amino acid sequence of CFTR showed striking homology to a superfamily of membrane-associated proteins involved in active transport known as the ATP-binding cassette (ABC) superfamily. Members of this superfamily have several features in common, notably the presence of transmembrane domains and nucleotide binding folds. (Adapted from Riordan [].) N-kapcsolt szénhidrátok Protein kináz C Protein kináz A Lizin, arginin és hisztidin Aszpartát és glutamin

68 Cysticus fibrosisban:
Cysticus fibrosisban a pancreas leginkább a lumen koncentrációk defektusára érzékeny, melyet az acinarisan szekretált sok fehérje okoz és a ductalis cysticus fibrosis transzmembrán konduktancia regulátoron keresztüli anion (klorid, bikarbonát) és folyadék-szekréciótól függ. Ductus Acinus Egészséges hasnyálmirigy: Gyors áramlás Alacsony fehérjetartalom víz anionok Ductus Acinus Figure 9-4. The pancreas affected by cystic fibrosis is most vulnerable to lumenal concentration defects caused by the high protein content of acinar secretions and dependence on ductal cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for anion (chloride and bicarbonate) and fluid secretion. When ductal water flow is reduced owing to defective anion secretion, protein concentration in the duct rises. High protein concentration causes precipitation of protein and plugging of duct lumina [],[]. In contrast, the sweat duct is unaffected pathologically because of low protein load and high flow rate. (Adapted from Forstner and Durie [].) Cysticus fibrosisban: Lassú áramlás Magas protein koncentráció Fehérje dugók víz anionok

69 A cysticus fibrosis transzmembrán konduktancia regulátor génmutációi
misszensz AA deléció nonszensz frame-shift splice defektus Figure 9-6. Distribution of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene mutations. The predominant mutation that causes cystic fibrosis (ΔF508) accounts for approximately 70% of mutant chromosomes screened []. Under the leadership of Dr. L.-C. Tsui, the Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium was formed in 1989 to pool knowledge and information concerning CFTR gene mutations. To date the Consortium has identified more than 500 sequence alterations. Most of these mutations are almost certainly associated with the disease. The distribution and nature of the mutations in the CFTR gene are shown. The boxes at the top represent exons; the functional domains of the CFTR protein are shown at the bottom. Each vertical bar shows the location of a mutation reported to the CF Genetic Analysis Consortium (as of May 1992). A variation suggests a benign amino acid substitution. (From Tsui []; with permission.) variáció teljes Membránt átérő ATP kötés R-domain Membránt átérő ATP kötés

70 Gén-mutációk típusai CF során
Normális Nonszensz G542X frame-shift 394delTT splice junction 1717 – 1G—A Misszensz AA deléció ΔF508 Misszensz G551D Misszensz R117H Misszensz A455E Alternatív splicing kbC—T Figure 9-9. Attempts have been made to define the different mutations into classes according to the functional properties of the gene product with respect to chloride regulation. A modified classification system, originally proposed by Tsui [], is shown. A, Normal mutations. B, Class I represents gene mutations for which the intact cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein product is not formed. Most nonsense mutations fit into this category. C, Class II represents the forms of mutation CFTR that fail to traffic to the apical membrane under physiologic conditions. ΔF508 is the most striking example of this class of mutations. D, Class III mutant CFTR proteins include those that are inserted into the apical membrane but fail to respond to stimulation with cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The relatively common missense mutation G551D is an example of a class III mutation. E, Class IV mutants produce protein that reach the apical membrane, generate cAMP-regulated apical membrane chloride current, but have altered channel properties, resulting in a reduction in the amount of current. Most mutations in this class are represented by the "mild" pancreatic sufficient CFTR gene mutations outlined in Table 9-3. F, Class V mutations are extremely rare. They result in reduced synthesis of normal functioning CFTR because of defective processing or aberrant splicing at alternative sites. Class IV and class V mutations have a strong association with the pancreatic sufficient phenotype. (From Wilchanski et al. []; with permission.)

71 A fogak röntgenfelvétele – a pulpakamra jól kivehető

72 A fogak morfogenezise

73 Osteogenesis imperfecta (OI) (a csont és a dentin betegsége) Az OI-t a COL1A1 gén (120150) vagy a COL1A2 gén (120160) mutációja okozza, vagyis a I. típusú kollagén két α láncai közül valamelyiknek a mutációja

74 Dentinogenesis imperfecta A dentin foszfoprotein (DPP), egy erősen savas fehérje, egyike a dentin legfontosabb nem-kollagén komponenseinek. Csak a fogak ectomesenchymális eredetű odontoblasztjai termelik. Takagi és Sasaki (1988) vetette fel először, hogy ennek a fehérjének a hiánya oki tényező a dentinogenesis imperfecta (DGI1; ) kialakulásában. MacDougall és mtsai (1997) mutatták ki, hogy a dentin 2 fő, nem-kollagén mátrix proteinjét, a dentin szialoproteint (DSP) és a dentin foszfoproteint (másnéven foszfoforint) egyetlen gén kódolja amelyet sialophosphoproteinnek (DSPP) is nevezünk.

75 Amelogenesis imperfecta A zománc, a fogak legkülső felszínét borítja, s a test legkeményebb szövete, fehérjéi az enamelin (606585) és az amelogenin. Az amelogeninek nagymértékben konzervált fehérjék, szekréciójukat az ameloblastok végzik, a zománc szerves mátrixának 90%-át alkotják. Ezek a fehérjék lebomlanak és alkotórészeik felszívódnak, s ezzel párhuzamosan az ásványi kristályok jól strukturált prizma alakzatokba növekednek. Southern blot analízis segítségével, Lagerstrom és mtsai. (1991) kimutatták, hogy az amelogenin gén ( ) 5 kb-ig is terjedő deléciója férfiakban az amelogenesis imperfecta hipomineralizált formájához vezet. A hordozó nők heterozigóták. A defektus legalább 2 exonra kiterjed. A deléciós méret polimeráz láncreakciós (PCR) analízissel kimutatható.

76 Génaktiválódás a fog fejlődése során
(az Msx1 és Pax9 gének közvetlen szerepét az emberi foghiányok kialakulásában már igazolták)

77 Oligodontia hypohidrotikus ectodermális dysplasiában (HED) szenvedő betegben - az ectodysplasin gén mutációja

78 Az ectodysplasin gén módosítja a fogak megjelenését
Normál egér Ectodysplasin -/- K.O. egér Ectodysplasin Overexpresszált egér

79 Clinical Genetics. Volume 63 Issue 5 Page 333 - May 2003. Mini Review
Clinical Genetics Volume 63 Issue 5 Page 333  - May   Mini Review It's only teeth - are there limits to genetic testing? MJ Aldreda, PJM Crawford, R Savarirayan and J Savulescu Dental genetic disorders can cause severe social and psychological effects in affected individuals. The cost of treatment can be considerable, not only in financial terms but also in time spent during treatment. In theory it is, or will soon be, possible to use advances in molecular genetics for pre-natal testing, for selection of embryos using in vitro fertilization techniques, and for gene therapy. The questions we pose are whether these approaches are appropriate. We hope that this review will stimulate debate on these issues.

80 Genomika A genom: Egy diploid sejt teljes haploid DNS tartalma +mitokondriális DNS A genomika: A genom működésének, szerkezetének, kölcsönhatásainak vizsgálata és az ezekhez tartozó módszerek. A nukleotidok vizsgálatán túl ide tartozik a fehérjék vizsgálata is, bioinformatika, „systems biology” stb. Genomika lehet pl.: Strukturális genomika Komparatív genomika Funkcionális genomika Humán genomika Farmakogenomika Orvosi genomika, stb.

81 A humán genom tulajdonságai (néhány kiragadott jellemző)
2003 április: a humán genom szekvenálása befejeződött Kb gént azonosítottak 1,2%-a az eukromatikus régiónak kódol fehérjét (exon) SNP-éket figyelembe véve két ember között átlagosan 1/1000 a különbség (99,9% egyforma) Átlagos exonszám: 12,2 exon/gén; Leggyakoribb intronméret: 87 bp; exonméret: 145 bp Legtöbb exon titin gén: 309 db

82 Mi az snip vagy SNP (Single Nucleotide Polymorphism)?
Ugyanahhoz a fajhoz tartozó két egyed között egyetlen bázis eltérése ugyanabban a DNS pozícióban, gyakoriság >1 % . ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT ATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGT   snp snp Az SNP-k replikációs hiba vagy DNS károsodás révén jönnek létre.

83 Mutáció és polimorfizmus
Frekvencia több mint 1% Kevesebb mint 1% Hatás semleges ??? betegség Rizikó faktorok Egypontos nukleotid variációk/ SNP (“snips”) az ismert különbségek 90%-a a legtöbb SNP csak 2 allél változatban fordul elő Hosszúság polimorfizmusok STR (short tandem repeats) 2-6 bp álló szakaszok tandem módon egymás után ismétlődnek, az ismétlődések száma a személyek között nagy változatosságot mutat. VNTR (variable number of tandem repeats) Változó hosszúságú ismétlődő szekvencia részek

84 Humán Genetikai Varibilitás
SNP szinten két ember átlagosan 0,1%-ban különbözik egymástól CCCCAGCCTCCTTGCCAACGCCCCCTTTCCCTCTCCCCCTCCCGCTCGGCGCTGACCCCCCATCCCCACCCCCGTGGGAACACTGGGAGCCTGCACTCCACAGACCCTCTCCTTGCCTCTTCCCTCACCTCAGCCTCCGCTCCCCGCCCTCTTCCCGGCCCAGGGCGCCGGCCCACCCTTCCCTCCGCCGCCCCCCGGCCGCGGGGAGGACATGGCCGCGCACAGGCCGGTGGAATGGGTCCAGGCCGTGGTCAGCCGCTTCGACGAGCAGCTTCCAATAAAAACAGGACAGCAGAACACACATACCAAAGTCAGTACTGAGCACAACAAGGAATGTCTAATCAATATTTCCAAATACAAGTTTTCTTTGGTTATAAGCGGCCTCACTACTATTTTAAAGAATGTTAACAATATGAGAATATTTGGAGAAGCTGCTGAAAAAAATTTATATCTCTCTCAGTTGATTATATTGGATACACTGGAAAAATGTCTTGCTGGGCAACCAAAGGACACAATGAGATTAGATGAAACGATGCTGGTCAAACAGTTGCTGCCAGAAATCTGCCATTTTCTTCACACCTGTCGTGAAGGAAACCAGCATGCAGCTGAACTTCGGAATTCTGCCTCTGGGGTTTTATTTTCTCTCAGCTGCAACAACTTCAATGCAGTCTTTAGTCGCATTTCTACCAGGTTACAGGAATTAACTGTTTGTTCAGAAGACAATGTTGATGTTCATGATATAGAATTGTTACAGTATATCAATGTGGATTGTGCAAAATTAAAACGACTCCTGAAGGAAACAGCATTTAAATTTAAAGCCCTAAAGAAGGTTGCGCAGTTAGCAGTTATAAATAGCCTGGAAAAGGCATTTTGGAACTGGGTAGAAAATTATCCAGATGAATTTACAAAACTGTACCAGATCCCACAGACTGATATGGCTGAATGTGCAGAAAAGCTATTTGACTTGGTGGATGGTTTTGCTGAAAGCACCAAACGTAAAGCAGCAGTTTGGCCACTACAAATCATTCTCCTTATCTTGTGTCCAGAAATAATCCAGGATATATCCAAAGACGTGGTTGATGAAAACAACATGAATAAGAAGTTATTTCTGGACAGTCTACGAAAAGCTCTTGCTGGCCATGGAGGAAGTAGGCAGCTGACAGAAAGTGCTGCAATTGCCTGTGTCAAACTGTGTAAAGCAAGTACTTACATCAATTGGGAAGATAACTCTGTCATTTTCCTACTTGTTCAGTCCATGGTGGTTGATCTTAAGAACCTGCTTTTTAATCCAAGTAAGCCATTCTCAAGAGGCAGTCAGCCTGCAGATGTGGATCTAATGATTGACTGCCTTGTTTCTTGCTTTCGTATAAGCCCTCACAACAACCAACACTTTAAGATCTGCCTGGCTCAGAATTCACCTTCTACATTTCACTATGTGCTGGTAAATTCACTCCATCGAATCATCACCAATTCCGCATTGGATTGGTGGCCTAAGATTGATGCTGTGTATTGTCACTCGGTTGAACTTCGAAATATGTTTGGTGAAACACTTCATAAAGCAGTGCAAGGTTGTGGAGCACACCCAGCAATACGAATGGCACCGAGTCTTACATTTAAAGAAAAAGTAACAAGCCTTAAATTTAAAGAAAAACCTACAGACCTGGAGACAAGAAGCTATAAGTATCTTCTCTTGTCCATGGTGAAACTAATTCATGCAGATCCAAAGCTCTTGCTTTGTAATCCAAGAAAACAGGGGCCCGAAACCCAAGGCAGTACAGCAGAATTAATTACAGGGCTCGTCCAACTGGTCCCTCAGTCACACATGCCAGAGATTGCTCAGGAAGCAATGGAGGCTCTGCTGGTTCTTCATCAGTTAGATAGCATTGATTTGTGGAATCCTGATGCTCCTGTAGAAACATTTTGGGAGATTAGCTCACAAATGCTTTTTTACATCTGCAAGAAATTAACTAGTCATCAAATGCTTAGTAGCACAGAAATTCTCAAGTGGTTGCGGGAAATATTGATCTGCAGGAATAAATTTCTTCTTAAAAATAAGCAGGCAGATAGAAGTTCCTGTCACTTTC CCCCAGCCTCCTTGCCAACGCCCCCTTTCCCTCTCCCCCTCCCGCTCGGCGCTGACCCCCCATCCCCACCCCCGTGGGAACACTGGGAGCCTGCACTCCACAGACCCTCTCCTTGCCTCTTCCCTCACCTCAGCCTCCGCTCCCCGCCCTCTTCCCGGCCCAGGGCGCCGGCCCACCCTTCCCTCCGCCGCCCCCCGGCCGCGGGGAGGACATGGCCGCGCACAGGCCGGTGGAATGGGTCCAGGCCGTGGTCAGCCGCTTCGACGAGCAGCTTCCAATAAAAACAGGACAGCAGAACACACATACCAAAGTCAGTACTGAGCACAACAAGGAATGTCTAATCAATATTTCCAAATACAAGTTTTCTTTGGTTATAAGCGGCCTCACTACTATTTTAAAGAATGTTAACTATATGAGAATATTTGGAGAAGCTGCTGAAAAAAATTTATATCTCTCTCAGTTGATTATATTGGATACACTGGAAAAATGTCTTGCTGGGCAACCAAAGGACACAATGAGATTAGATGAAACGATGCTGGTCAAACAGTTGCTGCCAGAAATCTGCCATTTTCTTCACACCTGTCGTGAAGGAAACCAGCATGCAGCTGAACTTCGGAATTCTGCCTCTGGGGTTTTATTTTCTCTCAGCTGCAACAACTTCAATGCAGTCTTTAGTCGCATTTCTACCAGGTTACAGGAATTAACTGTTTGTTCAGAAGACAATGTTGATGTTCATGATATAGAATTGTTACAGTATATCAATGTGGATTGTGCAAAATTAAAACGACTCCTGAAGGAAACAGCATTTAAATTTAAAGCCCTAAAGAAGGTTGCGCAGTTAGCAGTTATAAATAGCCTGGAAAAGGCATTTTGGAACTGGGTAGAAAATTATCCAGATGAATTTACAAAACTGTACCAGATCCCACAGACTGATATGGCTGAATGTGCAGAAAAGCTATTTGACTTGGTGGATGGTTTTGCTGAAAGCACCAAACGTAAAGCAGCAGTTTGGCCACTACAAATCATTCTCCTTATCTTGTGTCCAGAAATAATCCAGGATATATCCAAAGACGTGGTTGATGAAAACAACATGAATAAGAAGTTATTTCTGGACAGTCTACGAAAAGCTCTTGCTGGCCATGGAGGAAGTAGGCAGCTGACAGAAAGTGCTGCAATTGCCTGTGTCAAACTGTGTAAAGCAAGTACTTACATCAATTGGGAAGATAACTCTGTCATTTTCCTACTTGTTCAGTCCATGGTGGTTGATCTTAAGAACCTGCTTTTTAATCCAAGTAAGCCATTCTCAAGAGGCAGTCAGCCTGCAGATGTGGATCTAATGATTGACTGCCTTGTTTCTTGCTTTCGTATAAGCCCTCACAACAACCAACACTTTAAGATCTGCCTGGCTCAGAATTCACCTTCTACATTTCACTATGTGCTGGTAAATTCACTCCATCGAATCATCACCAATTCCGCATTGGATTGGTGGCCTAAGATTGATGCTGTGTATTGTCACTCGGTTGAACTTCGAAATATGTTTGGTGAAACACTTCATAAAGCAGTGCAAGGTTGTGGAGCACACCCAGCAATACGAATGGCACCGAGTCTTACATTTAAAGAAAAAGTAACAAGCCTTAAATTTAAAGAAAAACCTACAGACCTGGAGACAAGAAGCTATAAGTATCTTCTCTTGTCCATGGTGAAACTAATTCATGCAGCTCCAAAGCTCTTGCTTTGTAATCCAAGAAAACAGGGGCCCGAAACCCAAGGCAGTACAGCAGAATTAATTACAGGGCTCGTCCAACTGGTCCCTCAGTCACACATGCCAGAGATTGCTCAGGAAGCAATGGAGGCTCTGCTGGTTCTTCATCAGTTAGATAGCATTGATTTGTGGAATCCTGATGCTCCTGTAGAAACATTTTGGGAGATTAGCTCACAAATGCTTTTTTACATCTGCAAGAAATTAACTAGTCATCAAATGCTTAGTAGCACAGAAATTCTCAAGTGGTTGCGGGAAATATTGATCTGCAGGAATAAATTTCTTCTTAAAAATAAGCAGGCAGATAGAAGTTCCTGTCACTTTC

85 Az összes egyed genotipizálása sok ezer SNP-re
Betegség iránt fogékony populáció Az összes egyed genotipizálása sok ezer SNP-re ATGATTATAG ATGTTTATAG Az összes rezisztens személynek A van az X gén 4-es pozíciójában, míg minden fogékonynak T van ugyanabban a pozícióban génX Rezisztens populáció

86 Humán Genom Projekt révén felgyorsult
Örökletes betegség vagy öröklött állapot Térképezés Klónozott gén Humán Genom Projekt révén felgyorsult Diagnosztika Idő A betegség biológiai alapjainak megértése Preventív medicina Farmako- genomika Gyógyszeres terápia Génterápia

87 A genetika, a genomika és a génterápia orális/dentális alkalmazásának néhány kézenfekvő területe
• A fogfejlődés genetikai betegségei • A fej-nyak régió rákos betegségei • Caries képződés és fogerózió prevenciója • Csontdefektusok korrekciója • Krónikus fájdalom csökkentése • Parodontális gyulladás kezelése (emberi és bakteriális genomika) • Nyálmirigyek csökkent működésének gyógyítása • Szisztémás és szájüregi betegségek kezelése nyálmirigyek génterápiájával