ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)] Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas laboratóriumi.

Az előadások a következő témára: "ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)] Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas laboratóriumi."— Előadás másolata:

1 ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)]
Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas laboratóriumi eljárás Az áramlási citometria és citométer működésének elve. A minta preparálása. A sejtpopuláció azonosítása méret és granuláltság szerint, scatter plot. Immunfenotipizálás, fluoreszcens jelölés, hisztogram, dot plot. Sejtfelszíni és sejten belüli antigének kimutatása. További alkalmazási területek: sorting, sejtciklus-analízis. Klinikai alkalmazási területek (példákkal): diagnózis, terápia és betegség progresszió monitorozása, prognózis. Gyakorló feladatok. PÁLLINGER ÉVA

2 A FLOW CYTOMETRIA ELŐNYEI
SEJT / VIZSGÁLAT 1-2 MIN/ VIZSGÁLAT OBJEKTÍV (+/-) JÓ REPRODUKÁLHATÓSÁG AUTOMATIZÁLT MINTA ELŐKÉSZÍTÉS MIKROSZKÓPIA SEJT / VIZSGÁLAT 4-5 MIN/ VIZSGÁLAT SZUBJEKTÍV (+/-) GYENGÉBB REPRODUKÁLHATÓSÁG IDŐIGÉNYESEBB MINTAELŐKÉSZÍTÉS

3 Mit mond el az áramlási citometria a sejtekről?
A relatív sejtméretet (Forward Scatter—FSC) A sejtek relatív granuláltságát ill. belső komplexitását (Side Scatter—SSC) A fluoreszcencia intenzitásukat

4 Hogyan működik az áramlási citométer?
Folyadék rendszer: Biztosítja a sejtek áramlását, a sejteket a gerjesztés helyére fókuszálja Optikai rendszer: 1) fénygerjesztés: laser 2) az emittált fény eljuttatása a fotonsokszorozóhoz (PMT) Elektronikus rendszer: a fényjelek digitális jellé alakítása

5 Folyadék rendszer Flow cell (áramlási cella) laser sugár
Minta felvételi pont sheath flow (burok folyadék ) laser sugár Hidrodinamikus fókuszálás Minta áramlás Flow cell (áramlási cella)

6 Optikai rendszer A dikroikus filterek szelektíven engedik át a fényt. A fénysugár irányításában és a PMT-be jutó fény „kiválasztásában” van szerepük.

7 BD Facs Calibur

8 Milyen kérdéseket tehetünk fel egy áramlási citométernek?
Azonosíthatók a sejtpopulációk a vizsgálati mintában? (heterogenitás) Meghatározható a sejtek aktiváltsági, differenciáltsági és érési stádiuma? Jellemezhetjük a sejtek funkcionális állapotát? Meghatározhatjuk a sejtek abszolút számát a mintában? Detektálhatjuk quantitatív módon különféle szolubilis fehérjék jelenlétét a mintában? Fizikailag elválaszthatjuk (szeparálhatjuk) a sejteket egymástól? Válasz: IGEN

9 Milyen paramétereket használhatunk a kérdéseink megválaszolására?
Relatív méret és granuláltság (FSC/SSC) Fluoreszcens jelek a sejtfelszínről és/vagy a citoplazmából Fluoreszcens jelek időbeni detektálása

10 MEGFIGYELÉSI MÓDOK Sejtszuszpenzió!!!
FESTETLEN VIZSGÁLATI MINTÁK ANALÍZISE (sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint) FESTÉS FLUROKRÓMMAL JELZETT MONOKLONÁLIS ANTITESTEKKEL = IMMUNFENOTIPIZÁLÁS (sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján) SEJTALKOTÓRÉSZEKHEZ SPECIFIKUSAN KÖTŐDŐ FESTÉKEK ALKALMAZÁSA

11 Mintaelőkészítés Sejtszuszpenzió készítés Erythrolysis
Alvadt vérből (alvadékos vérből) nem lehet mérést végezni! Erythrolysis Festés (ha szükséges) Sejtalkotórészek közvetlen jelölése Immunfenotipizálás

12 Minőség ellenőrzés Technikai Biológiai
A készülék beállításának és állapotának ellenőrzése (napi és időszakos) Fluoreszcencia kompenzáció Biológiai A mintaelőkészítés ellenőrzése (pozitív és negatív kontrollok használata) Izotípus ellenanyag jelölés Autofluoreszcencia detektálás

13 Fényszórási jellegzetességek
Right Angle Light Detector (Side scatter parameter = SS) Granuláltság Forward Light Detector (Forward scatter parameter == FS) Sejtméret Light Source (LASER)

14 Sejtmegoszlás méret és struktúráltság szerint
Lymphocyta Basophil granulocyta Monocyta Neutrophil granulocyta Eosinophil granulocyta méret granuláltság

15 Sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint
Válasz: leukémiás csontvelő egészséges csontvelő Milyen eltérést lát a képen, mi okozhatja?

16 Mi is az a fluoreszcencia?
A fluorochrom energiát vesz fel a laser fényből (gerjesztődés)  = 488 nm kibocsátott fluorescens fény Antitest Fényenergia Fluorescens Molecula  = 520 nm HO CO2H O C A fluorochromok kibocsájtják a felvett energiát: A kibocsátott fény hullámhossza nagyobb, mint a gerjesztő fényé

17 Emissziós spektrum Wavelength (nm) 400 500 600 700 100% 0%
APC PerCP Wavelength (nm) 400 500 600 700 100% 0% Normalized Intensity FITC RPE 800 peridinin chlorophyll A protein Fluorescein isothiocyanate R-Phycoerythrin Allophycocyanin A kibocsátott fény hullámhossza függ: 1) a fluorokróm típusától, 2) a fluorokróm környezetétől

18 Fluoreszcencia intenzitás (log)
Fluoreszcencia Az emittált fluoreszcencia intenzitás arányos a gerjesztett festék molekulák számával FITC FITC Fluoreszcencia intenzitás (log) Sejtszám

19 A fluoreszcens jelek grafikus megjelenítése
Hisztogram Felhő kép (Dot plot)

20 Cluster of Differentiation = CD (Differenciálódási markerek)
SEJTTÍPUSOK Cluster of Differentiation = CD (Differenciálódási markerek) 1. Leukocyta szubpopulációk azonosítása 2. Leukocyták érési / funkcionális állapotának meghatározása „Az immunológia alapjai” TK Függelék 1. táblázat

21 MÓDSZEREK: ÁRAMLÁSI CITOMETRIA IMMUNHISZTOKÉMIA
Differenciálódási markerek FELHASZNÁLÁSA AZ IMMUNRENDSZER SEJTJEINEK VIZSGÁLATÁBAN: IMMUNFENOTIPIZÁLÁS MÓDSZEREK: ÁRAMLÁSI CITOMETRIA IMMUNHISZTOKÉMIA

22 Expresszió: IGEN (+) vagy NEM (-)
Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján IMMUNFENOTIPIZÁLÁS Megválaszolható (biológiai) kérdések: Expresszió: IGEN (+) vagy NEM (-) A „pozitív” és a „negatív” populációk %-os megoszlása A sejtek relatív fehérje expressziója Koexpresszió

23 Lymphocyta alcsoportok
Funkcionális és morfológiai (immunfenotípus) kategóriák CD3- CD56+ CD3+ CD19+ gdTCR+ CD4- CD8- CD8+ CD4+ IFNg+ IL-12+ TNFa,b+ IL4+ IL-5+ IL-10+ IL-13+ IL-17+ TGFb+ Ly T B NK Tc Th Th17 Th2 Th1 gdT NKT Plazmasejt ic könnyűlánc+ B1 B2 CD5+ CD25high+ Foxp3+ Treg Kb. ezt kell tudni az év végére.

24 „Igen-nem” válasz Jelen van-e a vizsgálati mintában a keresett sejttípus? Mekkora arányban van jelen? Mekkora az abszolút mennyisége?

25 Sejtfelszíni antigén expresszió mértéke
CD4high+ CD4dim+ lymphocyta monocyta Azonos mértékben expresszálják-e a vizsgálati minta sejtjei a keresett fehérjét? Mire lehet következtetni az expressziós eltérésekből?

26 IMMUNFENOTIPIZÁLÁS CD3+/CD8+ CD3+/CD8- CD3-/CD8+ CD3-/CD8- CD3-/CD8+: NK CD3+/CD8-: Th CD3-/CD8-: B, (NK) Milyen sejttípusba tartozhatnak a kettős negatívan festődő sejtek?

27 KLINIKAI PÉLDA AZ IMMUNFENOTIPIZÁLÁSRA

28 Myeloma multiplex: a plazmasejtek daganatos megbetegedése
Eset leírás: 36 éves férfi minimális traumát követően felkar törést szenvedett. Gyakran fáj a háta, időnként lázas is. Testsúly mérsékelten csökkent az utóbbi időben, változatlan táplálkozási szokások mellett. Fizikális vizsgálat: a láz és a hátfájdalom eredetére utaló jel nem észlelhető. RTG vizsgálat: diffúz osteoporosis a gerinc háti szakaszán Laboratóriumi vizsgálatok: anaemia, hypercalcemia, monoklonális paraprotein.  Iránydiagnózis: Myeloma multiplex Javasolt a csontvelő vizsgálata: kenet, FACS csontvelő Paraprotein = M-protein (lásd következő héten).

29 B SEJTVONAL DIFFERENCIÁLÓDÁSI ANTIGÉNEK
Pro B Pre B Éretlen B Érett Aktivált Plazmasejt lymphoid progenitor CD34+ CD19+ CD10+/- ic CD22+ HLA-DR+ TdT+ CD34+/- CD20+ CD10+ ic m + CD21+ CD22+ sIgM+ CD34- CD10- sIgM+/sIgD+ FcR+ CD11b+ sIg+ CD19- CD45- CD38+ sIg- ic k+ v. ic l+ ckit (CD117) + B SEJTVONAL DIFFERENCIÁLÓDÁSI ANTIGÉNEK csontvelő antigén-független periféria antigén-függő

30 A Myeloma multiplex diagnosztikája FACS módszerrel
CD45/CD14 CD45/CD38/HLA-DR CD45/CD138 CD10/CD5/CD19 CD34/CD33/CD19 CD22/CD20 Kappa/Lambda/CD19 intracelluláris kappa/lambda CD4/CD8/CD3 KONSZENZUS PROTOKOLL

31 Csontvelő (FACS) CD45/CD38 jelölés CD38 pozitív CD45 negatív
Nagy méretű sejtek

32 CD45/CD138 jelölés CD45 negatív CD138 pozitív Nagy méretű sejtek

33 Sejtfelszíni k/l/CD19 jelölés

34 Citoplazmatikus k/l jelölés
Citoplazmában sok l Nagy méretű sejtek Immunfenotípus: CD45-/CD19-/CD38+/CD138+/iclambda+: plazmasejt

35 REGULATÓRIKUS T SEJTEK
Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásával KLINIKAI PÉLDA CD4+/CD25+ CD4+/CD25high+ AKTIVÁLT Th SEJTEK REGULATÓRIKUS T SEJTEK

36 A sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásának klinikai jelentősége
Izotípus kontroll 1. vérvétel 2. vérvétel A monociták HLA-DR expressziójának csökkenése rossz prognózist jelent szeptikus állapotokban.

37 Technikai vonatkozások
Kalibrációs görbe Technikai vonatkozások * M1 y = 1,0076x – 1,6642 r2 = 0,999

38 Immunfenotipizált sejtek további vizsgálati lehetőségei: sejtszeparálás („sorting”)

39 Mechanikus szortolás „WASTE” MINTA ÁRAMLÁSI CELLA SZEPARÁLT SEJTEK

40 Elektrosztatikus szortolás
ÁRAMLÁSI CELLA SZEPARÁLT SEJTEK 1 MINTA „WASTE” SEJTEK 2 KONDENZÁTOR ELEKTROMOS TÖLTÉS

41 Sejtpopulációk jellemzése sejtszeparálás után
KUTATÁSI PÉLDA RNS izolálás HDC expresszió Csontvelő CD34+ sejtek

42 Sejtalkotórészekhez specifikusan kötődő festékek alkalmazása

43 SEJTCIKLUS ANALÍZIS: PI festés
„S” fázis emelkedés malignus sejtekben Propidium jodid (PI) a kétszálú DNS-hez és RNS-hez sztöchiometrikusan kötődő fluorokróm. Alkalmazásával lehetőség nyílik a nekrotikus, az apoptotikus és az ép sejtek elkülönítésére. Klinikai jelentőség: malignus sejtek osztódási képességének jellemzése

44 A flow cytometria klinikai alkalmazása

45 Klinikai megközelítés
Diagnózis Terápia monitorozás Prognózis Pathológiás állapotok aktivitásának nyomonkövetése

46 Rutin vizsgálatok célja
Sejtarányok és abszolút sejtszámok meghatározása Pathológiás sejtek kvalitatív és kvantitatív analízise Aktivációs markerek kimutatása Sejtciklus vizsgálatok Sejtek funkcionális jellemzése

47 A flow cytometria helye a rutin klinikai gyakorlatban
HEMATOLÓGIAI KÓRKÉPEK IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK Autoimmun betegségek HLA-asszociált betegségek Fertőzések

48 A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN

49 A malignus haematológiai betegségek diagnosztikája
Klinikai tünetek Morfológia Quantitativ és qualitativ vérkép Csontvelő kenet ill. biopszia Cytokémia Flow cytometria, immunhisztokémia Cytogenetika, molekuláris genetika

50 A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN
DIAGNÓZIS / DIFFERENCIÁL DG. MARADÉK LEUKAEMIA (minimal residual disease) BETEGSÉG KIÚJULÁS (recidiva) CHEMOTHERÁPIA MONITOROZÁS MULTIDRUG REZISZTENCIA

51 DIAGNOSZTIKUS SÉMA A LEUKÉMIÁK VISGÁLATÁHOZ
AKUT LEUKÉMIA AML, AMML ALL nonT-ALL T-ALL CALLA+ CALLA- CALLA = common acute lymphoid leukemia antigen = CD10 A legfontosabb prognosztikus marker az ALL diagnosztikájában

52 MULTIDRUG REZISZTENCIA
MDR fehérje vizsgálata FACS módszerrel Pgp kimutatás (immunfenotipizálás) Pgp funkcionális jellemzés (pl. Calcein)

53 FL Aktív pumpa funkció Fluorokrómmal feltöltött sejt sejtszám

54 IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK
CONGENITÁLIS (PRIMER) ŐSSEJT DEFEKTUSOK A TERMÉSZETES IMMUNRENDSZER MŰKÖDÉSI ZAVARAI A HUMORÁLIS IMMUNVÁLASZ ZAVARAI A CELLULÁRIS IMMUNVÁLASZ ZAVARAI SZERZETT (SZEKUNDER) pl. HIV fertőzés

55 NORMÁL SEJTARÁNYOK VÁLTOZÁSÁNAK DETEKTÁLÁSA IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOKBAN
lymphocyta szubpopulációk vizsgálata: CD45/CD14 (quality control: ly kapu tisztasága) CD3/CD19 (T / B arány) CD3/CD56 (T / NK arány) CD8/CD4/CD3 (Tc / Th arány) CD5/CD19 (B1 B, össz B) CD4/CD3/CD45RO (Memória T) sIgM/sIgD/CD19 (naiv B) CD4/CD3/CD45RA (Naiv T) CD4/CD8/CD25 (aktivált T, ill. Treg) k/l /CD19 (B sejt klonalitás) TCR g/d

56 CD3+/CD4+ Th SEJTEK QUANTITATÍV MEGHATÁROZÁSA IMMUNSTÁTUSZ MONITOROZÁS
VIZSGÁLATOK AIDS-BEN CD3+/CD4+ Th SEJTEK QUANTITATÍV MEGHATÁROZÁSA  PROGNÓZIS IMMUNSTÁTUSZ MONITOROZÁS

57 A flow cytometria helye az autoimmun betegségek diagnosztikájában
Nem diagnosztikus értékű Jó prognosztikus paraméterek A betegség aktivitásának nyomonkövetése

58 HLA-ASSZOCIÁLT BETEGSÉGEK
Diagnózis alátámasztása Prognosztikus jelentőség Kockázati tényező Leggyakoribb klinikai alkalmazás HLA-B27 expresszió vizsgálata perifériás leukocitákon (Bechterew)

59 A FLOW CYTOMETRIA HELYE A FERTŐZÉSES ÁLLAPOTOKBAN
Az immunrendszer válaszkészségének monitorozása VÍRUS FERTŐZÉSEK: CD4/CD8 ARÁNY CSÖKKEN BAKTERIÁLIS FERTŐZÉSEK : ABSZOLÚT CD4+ és CD8+ T SEJT SZÁM CSÖKKENÉS SZEPSZIS CD14DIM/CD16HIGH/HLA-DR+/CD4+/CR1+ MONOCYTA SZUBPOPULÁCIÓ NŐ CD14+/HLA-DR+ MONOCYTA CSÖKKEN T SEJT AKTIVÁCIÓ NYOMONKÖVETÉSE T SEJT APOPTÓZIS MEGHATÁROZÁSA

60 FUNKCIONÁLIS TESZTEK

61 Sejtfunkciók vizsgálata autoimmun betegségekben
A BETEGSÉG AKTIVITÁSÁNAK NYOMONKÖVETÉSE Th1/Th2 sejtarány kimutatása az intracelluláris citokinek detektálásával Szolubilis citokinek kimutatása testnedvekben (mikrogyöngy módszer)

62 Intracelluláris citokin kimutatás
Milyen sejtpopulációk láthatók az ábrák bal felső részén?

63 Szolubilis citokin kimutatás
Y * mikrogyöngy Y Citokint felismerő ellenanyag 1. * Fluorokrómmal jelzett citokint felismerő ellenanyag 2. Citokin Melyik korábban tanult módszerhez hasonlít?

64 Sejtfunkciók vizsgálata immunhiányos állapotokban
FAGOCITA KÉPESSÉG VIZSGÁLATA (FLUOROCHROMMAL JELZETT PARTIKULUMOK FELVÉTELE) ROI TERMELÉS VIZSGÁLATA

65 Fagocita képesség vizsgálata

66 ÖSSZEFOGLALÁS

67 A FLOW CYTOMETRIA ABSZOLÚT INDIKÁCIÓS TERÜLETEI
Malignus hematológiai betegségek diagnosztikája és differenciáldiagnosztikája Minimális reziduális betegség kimutatása Multidrug rezisztencia vizsgálata Csontvelő transzplantáció nyomonkövetése AIDS

68 A FLOW CYTOMETRIA RELATÍV INDIKÁCIÓS TERÜLETEI
Autoimmun betegségek aktivitásának nyomonkövetése HLA-asszociáció kimutatása Fertőzések nyomonkövetése Sejtciklus analízis Sejtfunkciók detektálása Receptro expresszió kimutatás

69 Irodalom: Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 5. fejezet. Falus A, Buzás E., Rajnavölgyi É. (Szerk.): Az immunológia alapjai, fejezet Következő hétre: Immunszerológia Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 3. fejezet.

70 Milyen sejtek szaporodtak fel a vizsgálati mintában?
Fakultaív gyakorlás Milyen sejtek szaporodtak fel a vizsgálati mintában? Mi a diagnózis?

71 PRE-PRO B SEJTEK: CD34+/CD10+/CD19+
1. PRE-PRO B SEJTEK: CD34+/CD10+/CD19+

72 2. Homogén ly-blaszt populáció Granulocyta kevés CD45dim+/HLA-DR+

73 2. CD34+/CD33+

74 2. CD45dim+/HLA-DR+/ CD34+/CD33+/CD7+  AML CD7+/CD13+

75 3. Ly populáció  Sok HLA-DR+ ly

76 3. Ly kapun belül sok CD19+/CD5+ B1 B sejt

77 3. A CD19+ B sejtek lambda könnyűláncot expresszálnak (klonális felszaporodás)

78 CD45+/CD19+/CD5+/sejtfelszíni lambda+/HLA-DR+
3. CD45+/CD19+/CD5+/sejtfelszíni lambda+/HLA-DR+  B-CLL

79 Animált tutorial