A gének és betegségek kapcsolata

Az előadások a következő témára: "A gének és betegségek kapcsolata"— Előadás másolata:

1 A gének és betegségek kapcsolata
Molnár Mária Judit A gének és betegségek kapcsolata Molnár Mária Judit

2 Klinikai Genetika – Genomikai Medicina
A gének és betegségek kapcsolata Molekuláris biológiai metodikák Onkogenetika (solid tumorok, onkohaematológia) Kromoszóma rendellenességek, veleszületett rendellenességek és dysmorphiás syndromák Monogénes betegségek klinikai manifesztációja Neurogenetikai betegségek Belgyógyászati betegségek Haematológiai betegségek Cardiológiai betegségek Szemészeti betegségek Bőrgyógyászati betegségek Polygénes, multifaktoriális betegségek genetikája Személyre szabott orvoslás Közvetlenül a fogyasztók által rendelhető genetikai vizsgálatok A genetikai betegségek megelőzése: szűrés, genetikai tanácsadás A genetikai betegségek kezelési lehetőségei A genetikai orvoslás etikai és jogi aspektusai

3

4 1953 4

5 Év Nobel-díjasok Felfedezés
1953 F. Crick, J. Watson, M. Wilkins DNS molekula szerkezete 1965 F.Jacob, J. Monod, A. Lwoff Genetikai szabályozás 1966 P. Rous Onkogén vírusok 1968 R. Holley, G. Khorana, M. Nireberg A genetikai kód megfejtése 1975 D. Baltimore, R. Dulbecco, H. Temin Interakció a tumor vírusok és a nuclearis DNS között 1978 W. Arber, D. Nathans, H. Smith Restrictios endonuclease 1980 B. Benacerraf, J. Dausset, G. Snell Immunológiai válaszok genetikai kontrollja 1983 B. McClintock Mobil gének (transposonok) 1985 M. Brown, J. Goldstein Sejt receptorok familiáris hypercholesterinaemiában 1987 S. Tonegawa Antitestek genetikai aspektusa 1989 M. Bishop, H. Varmus Onkogének tanulmányozása 1993 R. Roberts, P. Sharp ‘Split gének’ 1995 E. Lewis, C. Nüsslein-Volhard, E. Wieschaus Homeostasis és egyéb fejlődéstani gének 1997 S. Prusiner Prionok 1999 G. Blobel Fehérje transzport signaling 2000 A. Carlsson, P. Greengard, E. Kandel Signal transductio az idegrendszerben 2001 L. Hartwell, T. Hunt, P. Nurse Sejtciklus regulátorok 2002 S. Brenner, R. Horritz, J. Sulston Genetikai szabályozás a fejlkődésben és programozott sejtahalál (apoptosis) 2006 A. Fire, C. Mello RNS interferencia

6 Mi a genomika ? biológiai összhangzattana
DNS szintű variációk és a gén expressziós mintázatok összességének bioinformatikailag értékelt biológiai összhangzattana

7 „systems biology”= rendszer-szemléletű biológia
Genom-Alapú Biológia „systems biology”= rendszer-szemléletű biológia NFkB genomikai adatbázisok „high-throughput” technológiák bioinformatika

8 Humán Genom Program

9 “Welcome to the Genomic Era” Guttmacher and Collins, NEJM 2003;349:996
DNA 50th Anniversary Human Genome Sequence “DNA Changed the World: Now What?” NY Times, February 25, 2003

10 Három „törvény” The amount of available DNA sequence data will double every 18 months The number of available genomes will double every 18 months The cost of sequence will drop by a factor of 2 every 18 months.

11 A modern biológia fejlődése
populációk (Darwin) egyedek (Mendel) tervezett élőlények sejtek (szintetikus biológia) kromoszómák modellek (rendszerbiológia) egyedi gének, fehérjék, molekulák egyszerre sok gén, molekula (molekuláris biológia) (genomika, proteomika, stb.) 1850 1900 1950 2050 2000 Pósfai György ábrája

12 A DNS-ben lévő információtömeg hatalmas
(22 + 1) pár kromoszóma 3.2 milliárd nukleotid bázis ~ gén (genom 1.4%) 2 m DNS 1014 sejt– 5.9 fénynap

13 Egy gén DNS szekvenciájának megváltozása megváltoztathatja a kódolt fehérjét
13

14 Az emberi sokféleség genetikai alapja
Frequency Example Rules for assigning allele to class Class of variation 5,692,700 (~93%) A/T Single base substitution involving A,T,C, or G Single Nucleotide Polymorphism (SNP) 431,319 (~7%) T/-CCTA/G Designated using the full sequence of the insertion as one allele, and either a fully defined string for the variant allele or a “-” character to specify the deleted allele. Deletion/Insertion Polymorphisms (DIPs) 2,440 (0.04%) gatagatagatagata Alleles are designated by providing the repeat motif and the copy number for each allele. Microsatellite or short tandem repeat (STR) 1,859 (0.03%) (alu) / - Applies to insertion/deletion polymorphisms of longer sequence features, such as retroposon dimorphism for Alu or line elements. Named variant Derived from dbSNP release 119

15 Hosszuk 2-50 bp és introni régióban vannak.
Az STR olyan mintázat, ahol 2 vagy több nt ismétlődik és az ismétlődő sequenciák közvetlenül egymás mellett vannak Hosszuk 2-50 bp és introni régióban vannak. STR polymorphismus azt jelenti, amikor a homolog STR locusok repeat száma az egyedek között különbözik. Egy adott elhelyezkedésű adott sequencia a genomben meghatározza az egyén genetikai profilját.

16 Combined DNA Index System (CODIS) DNA database funded by the FBI
1 aatttttgta ttttttttag agacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg actatggagt 61 tattttaagg ttaatatata taaagggtat gatagaacac ttgtcatagt ttagaacgaa 121 ctaacgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagacagat 181 tgatagtttt tttttatctc actaaatagt ctatagtaaa catttaatta ccaatatttg 241 gtgcaattct gtcaatgagg ataaatgtgg aatcgttata attcttaaga atatatattc 301 cctctgagtt tttgatacct cagattttaa

17 Transposon- jumping gene
Class I – Retrotransposon 2 lépésben iródik át: 1. DNSből RNS transcriptióval, majd RNS ből DNS reverse transcriptióval. Ezt követően a DNS kópia az genomban új helyre ékelődik be. Class II - DNS transposon Itt az RNS nem iktatódik közbe, tarnsposonase katalizál. „Cut and paste”- a retrovirus ezzel a módszerrel integrálódik. A transposonok mutagének Ha funkcionális génbe insertálódik tönkreteszi annak a funkcióját - Ha elhagyja a gént a fennmaradó „lukat” nem tudja javitani a sejt - Alu elementek gátolják a mitosis and meiosis alatt a chromosomák párosodását így egyenőtlen crossovert eredményeznek és ez okozza leggyakrabban a chromosomák duplikációját.

18 A kis 7SL cytoplasmikus RNS-ből származik
Az Alu elemek a DNS erősen repetitiv szekvenciái CpG szigetekben gazdagak, max 300 bp hosszúak, melyek a human genom legmobilisabb elemei (transposon). Tartalmaz funkcionális RNS polymerase III promotert, intermedier nem-codoló elementeket, és RNS-szerű poly(A) farkat. A kis 7SL cytoplasmikus RNS-ből származik Az Alu inserciókat több human betegséggel és rosszindulatú daganattal is kapcsolatba hozták. Pl. ha kódoló régióba insertálódik: neurofibromatosis, haemophilia, agammaglobulinaemia, leukemia, emlőrák, ovárium tu alakulhat ki

19 Centralis dogma: egy gén, egy protein

20 A DNS-től a Proteomig Genom Mi történhetne? Transcriptom Mi történhet?
Proteom Mi történik

21 A génszabályozás ma ismert epigenetikai tényezői
Methylation Phosphorylation P Acetylation Ac Ac Ac Ac Me Ub MicroRNA Histone proteins Ac Ac Me Ub AAA Ub SUMO Ub Ubiquination Sumoylation

22 Lehetséges epigenetikus hatással rendelkező viselkedéses és társas tényezők
Szülői magatartás Krónikus stressz Életmód Metiláció = gyengítés Acetiláció= erősítés

23 Mi történik a „rossz” patkányanya kölykeivel?
Glukokortikoid receptor gén („fő stresszreceptor”) metilációja a stresszre adott válasz egyik központi meghatározója stresszelhetőség nő 1,2 ERα ösztrogénreceptor metilációja nőihormon receptor, mely az anyai viselkedést is meghatározza fogamzóképesség és anyai magatartás csökken IV BDNF metilációja általános regeneráló és öregedést gátló vegyület gyengébb ellenállóképesség, rosszabb hangulat, gyorsabb öregedés 1Weaver et al (2004). Nat Neurosci 7(8): Szyf et al (2005). Front Neuroendocrinol 26(3-4): 3,4Champagne et al (2003, 2006) Physioll Behav, 79(3), 359–371. Biol Psychiat, 59(12), 1227–1235 5Roth et al (2009). Biol Psychiat, 65(9), 760–769.

24 98.7% -a az emberi genomnak nem kódol fehérjét
(„junk”?!?) 98%

25 A főbb genom technológiák
DNS Sequencia Sequencia változások Kópiaszám változás SNP variációk Messenger RNS (gén expresszió) Micro RNS Protein-DNS kötődés (transcription factor binding) Specifikus proteinek szintje (mass. Spec) Protein conformatiós változások (mass. Spec) Protein-protein interactiok (mass. Spec/2-hybrid) Protein elhylezkedés Genetikai interakciók

26 GÉNHÁLÓZATOK- ÚTVONAL ANALÍZIS
METODIKAI REPERTOIRE TELJES GENOM VIZSGÁLAT FEHÉRJE FIZIKAI TECHNIKÁK Biofizika, nanofizika GCAATCGATCTGGTACAGTAGCTA GCAATTGATCGGGTACATTAGCTA Hap-Map/ 20 millió pontmutáció ADATBÁZISOK BIOINFORMATIKA GÉNHÁLÓZATOK- ÚTVONAL ANALÍZIS EXPRESSZIÓS MICROARRAY/CHIP NANOTECHNOLÓGIA, Szilárd Fázisú KÉMIA NYELVÉSZET ELJÁRÁSOK

27 SNP

28 Genotyping Hybridization based methods Enzyme based methods
Eg. SNP microarrays Enzyme based methods RFLP PCR based methods Other postamplification methods based on the physical properties of the DNA SSCP DHPLC

29 Illumina SNP Tipizálás
Single Nucleotide Polymorphisms 1 every ~1200 bp (~5M/person) > 6,200,000 validated SNPs Genomic DNA [ T/C ] ‘T’ Allele Primer A G ‘C’ Allele Primer 23&Me 399 USD SNP meghatározását kínálja

30 Whole Human Genom Microarray Kit
Microarray metodika Amplifikáció és jelölés Mintából RNS izolálás RNS minőség ellenőrzése Az összes (44.000) gén expressziójának kumulált ábrázolása Hibridizáció Bioinformatikai kiértékelés A mRNS tisztítása gyári kit-el történik, majd a tisztaság és az integritás ellenőrzése után a mRNS-t amplifikáljuk és egy-szín (Cy-5, fluoreszcensz) jelölést alkalmazunk. A hibridizáció az Agilent 4x 44 ezer emberi génpróbát tartalmazó lemezén történik a gyári előírásnak megfelelően. A leolvasás után az adatok normalizálása, majd bioinformatikai értékelése történik. A középső blokkban az összes gén expresszióját kumulálva mutatjuk. AGILENT Adatnormalizálás Feature Extraction Scannelés Whole Human Genom Microarray Kit 4x44K – G4112F

31 Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH)
Delivering decisions from DNA to investigate genomic imbalance at a much higher resolution than is possible by traditional metaphase cytogenetic techniques (FISH)

32 1 2 5 4 3 Reference sample Test sample DNA isolation Microarray image
Deletion Deletion Deletion Deletion Deletion Reference sample Test sample DNA isolation 1 Microarray image DNA DNA DNA labelling 2 Bioinformatical analysis Bioinformatical analysis Bioinformatical analysis 5 Hybridization to microarray slides Scanning 4 3

33 Sanger sequencing Chain termination method
The key principle of the Sanger method was the use of dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) as DNA chain terminators

34 Next Generation Sequencing High Throughput Techniques
Lynx Pyrosequencing Illumina Solid Etc. Allele frequency determination in pooled samples derived from amplicon resequencing with Illumina

35 Orvosi Genomika Milyen gének vesznek részt a kóros fenotípus kialakításában A genom hogyan befolyásolja az egyes betegségekre való hajlamot a gyógyszer reaktivitást és mellékhatást – farmakogenomika Hogyan befolyásolhatjuk a genom működését: génterápia Mi a genom-környezet kölcsönhatásának szerepe a betegségek kialakulásában - epigenetika

36 Molekuláris genetikai diagnosztika
Infektológiai diagnosztika (pl. HPV) Genetikai azonosítás apaság, igazságyügyi orvostan Genetikai diagnosztika Somatikus átrendeződés tumorokban Tumorokban megváltozó génexpressziók Genetikai rizikótényezők Farmakogenomika Monogénes beteségek

37 “Except for being hit by a car when crossing the street, all human disease is genetic.”
Reed Pyeritz, MD Newsweek, 1981

38 Monogénes vs Complex Betegségek

39 Monogénes Betegségek: Sikertörténet

40 Heritabilitás A genetikai faktorok milyen arányban vesznek részt a betegség kialakításában Huntington-kór Schizophrenia gének környezet Rheumatoid Arthritis Hyperlipidaemia 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100 %

41 Genetic diseases Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)
A catalog of human genes and genetic disorders

42 Komplex fenotípusok Mit várhatunk?
gén 1 gén 1 gén 2 gén 5 gén 2 környezet gén 3 gén 4 környezet Kevés gén a környezeti faktorokkal együtt magas rizikót okozhat Sok gén a környezeti faktorokkal együtt alacsonyabb rizikóval jár

43 Complex polygénes betegségek génjeinek azonosítása nagy kihívás
A gén variánsok hatása kicsi (gyenge genotypus-phenotypus asszociáció) A környezet, a diéta, az életstílus befolyásolja a betegségek génjeinek expresszióját – epigenetika A GWAS vizsgálatok leginkább a gyakori és nem a ritka variánsokat vizsgálták Nagy populációk szükségesek, ahhoz hogy a GWAS vizsgálatoknak statisztikai ereje legyen A klinikai vizsgálatokban sokszor rossz volt a vizsgálati terv, a populáció struktúrája, az etnikai összeállítása (az SNPk frequenciája az egyes etnikai csoportokban különböző) Sok kezdeti asszociáció nem reprodukálódott a későbbi vizsgálatokban  a klinikai validálás hibája

44 A genetikai rendellenességek típusai
A nukleáris genom rendellenessége (23 pár kromoszóma, 3 milliárd bázis, ezer gén) Kromoszóma-rendellenességek Monogénes betegségek Oligo- és poligénes betegségek Epigenetikai módosulások Mitokondriális genom rendellenessége (17 ezer bázis, 37 gén) 44

45 Öröklődésmódok Mendeli öröklődés (AD, AR, XR, XD, Y)
Multiplex allélek, komplex öröklődés- vércsoport Uniparentalis disomia (meiosis hiba) pl. Angelman sy. Genomialis imprinting 80 imprinted humán gén (pl Prader Willi sy.) Mitochondrialis öröklődés

46 Genetikai ok: a 15q11-q13 deléciója
Epigenetika Angelman szindróma Súlyos mentális retardáció, ataxia, „vidám” megjelenés, epilepszia Prader-Willi szindróma Mentális retardáció, obesitas, hypogonadismus Genetikai ok: a 15q11-q13 deléciója Anyai kromoszóma deléció (UBE3A gén) Apai kromoszóma deléció Ubiquitin-protein ligase E3A methilációs probléma – sex specifikus imprinting.

47 Mitochondriális öröklődés
A mitochondriális DNS: bázis, 37 gén: 13 protein (légzési lánc), 22 tRNS, 2 rRNS. De: a mitochondriális fehérjék száma ~1500. Döntő részüket a nukleáris genom kódolja! A petesejt – kópia mitokondriális DNS-t tartalmaz (polyplasmia).

48 Minden mitochondriumnak saját DNS-e van
mitochondrium/sejt Minden mitochondriumnak saját DNS-e van Az mtDNS kis, kerek, polyplasmikus, maternálisan öröklődik Nincs repair rendszere A mitochondrion is a structure formed by two membranes separated by a space, the outer and the inner membrane, which forms these foldings called the cristae. The space enclosed by the inner membrane is the matrix, which appears moderately dense. In the matrix you find strands of DNA, ribosomes or small granules. A mitochondrion can be 1-10 m big and are present in the cytoplasm of all eukaryote cells of animals and higher plants an also in some microorganisms such as fungi.

49 Mitochondrialis medicina
mtDNS sequencia Mitochondrialis medicina Diagnostika mtDNS betegségek Populáció genetika Antropologiai marker

50 Az mtDNS populációgenetikai jelentősége
Maternalis öröklődés, nincs recombináció mtDNS variációk = haplotypusok (a D-loop alapján 27 haplotypus) Filogeographia

51 Human mtDNS morbiditási térképe
51

52 Genetikai tesztek Biokémiai genetika Cytogenetika Molekuláris genetika
52

53 Biokémiai genetika Metabolitok: pl. hosszú szénláncú zsírsavak gázkromatográfiája Fehérje szerkezet: pl. dystrophin Western blot dystrophinopathiak esetében Enzimaktivitás: pl. foszforiláz aktivitás McArdle betegség, alpha glucosidase Pompe kór 53

54 Cytogenetika (kromoszóma rendellenességek detektálása)
Klasszikus kromoszóma analízis: karyotipus Kromoszoma átrendeződések vizsgálata: speciális festési technikák Mikrodeléció szindróma, duplikációk detektálása: pl. FISH 54

55 Monogénes betegségek mutációs profiljai
Átrendeződések Pontmutációk Nukleotid repeat expansiok 55

56 Gén átrendeződés Átrendeződések Deléció
Intragénikus (in frame, out of frame) pl. Duchenne MD, HNPP Nem egy génhez köthető (sokféle hatás) pl. FSH Duplikáció pl. CMT1a (PMP22) Átrendeződések detektálása Southern blot Real Time PCR MLPA Quantitativ fluorescens fragment hossz elemzés 56

57 Deléció típusok eat the big mac – vad típus In frame deléció
eat the mac– in frame deléció Out of frame deléció eat the big mac eah ebi gma – out of frame deléció 57

58 Pontmutációk – nem synonym egyes nukleotid polymorphizmusok
Nonsense Missense Splice site mutáció Pontmutáció detektálása PCR – RFLP, Real-Time PCR Szekvencia analízis 58

59 Nukleotid repeatek Ismétlődő szekvenciák (CAG, CGG, GAA, CTG, CCTG, ATTCT) a genomban Ismétlődő egységek: 3, 4, 5 nukleotid 59

60 Trinukleotid repeat betegségek
I. típus II. típus Betegség Huntigton kór, SCA, FRAXA, dystrophia myotonica, Friedreich ataxia Ismétlődő egység CAG CGG, CTG, GAA Instabilitás foka közepesen stabil nem stabil Repeat lefordítódik-e proteinre igen nem Patológia speciális neuronok károsodása multiszisztémás betegségek Patomechanizmus toxikus proteinek hatása hypermetiláció, transkipciós interferencia, toxikus mRNS 60

61 Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside
Green ED and Guyer MS: Nature 2011; 470, 204–213

62 A genetikai markerek szerepe a betegellátásban