Monoklonális ellenanyagok

Az előadások a következő témára: "Monoklonális ellenanyagok"— Előadás másolata:

1 Monoklonális ellenanyagok
egyetlen B-limfocita klón termékei homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus) kiszámítható hatás, kevés mellékhatás - humán szervezetben patológiás körülmények között, plazmasejt klón malignus szaporulata miatt (myeloma multiplex) előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben („pharmacology-grade”) állíthatók elő

2 egyetlen B-limfocita klón több B-limfocita klón
Monoklonális ellenanyag több B-limfocita klón Poliklonális ellenanyag

3 A poliklonális és monoklonális ellenanyagok jellemzői
Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma Több (gyakori keresztreakciók) Egy (de gyakori keresztreakciók) Legtöbbször egy Specificitás polispecifikus gyakran polispecifikus monospecifikus Affinitás Változó (többféle ellenanyag) kicsi nagy Nem-spec. Immunglobulinok koncentrációja magas alacsony Hozam Előállítási költség Standardizálhatóság nem, ill. nehézkes egyszerű Mennyiség limitált korlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függő gyenge kiváló Poliklonális ellenanyag: Egy adott antigén több epitópja ellen irányuló antitestek keveréke.

4 Monoklonális ellenanyag előállítás menete
Hibridoma technika Vázlatosan 1. egér/patkány beoltása antigénnel lép vagy nyirokcsomó eltávolítása, homogenizálása lépből származó plazmasejtek + B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/mielóma sejtek) fúziója Az ellenanyag termelő klónok azonosítása. A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatban feldúsul (in vitro korlátlan ideig fenntartható specifikus immunológiai tulajdonságú sejtek)

5 Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan 2.
Lép Immunzálás Mielóma sejt HGPRT- B sejtek, HGPRT+ PEG fúzió HAT szelekció Sejteket tartalmazó lyukak felülúszójának tesztelése A hibrid sejtek szelekciója aminopterin * HAT= hypoxanthin, aminopterin, thymidin *Hypoxantin-guanin foszforibozil transzferáz

6 (1) Egér immunizálása (2) B sejtek izolálása a lépből (3) Myeloma sejtek kinyerése (4) Myeloma és B sejtek fúzionáltatása (5) A sejtvonalak izolálása (6) A megfelelő sejtvonalak kiválasztása szűrőmódszerekkel (7) in vitro (a) vagy in vivo (b) sokszorosítás (8) Monoklonális antitest termeltetés

7 Monoklonális ellenanyag termelés hatékonyságát
befolyásoló tényezők Antigén specifikus B-limfociták aktiválása - egér: beltenyésztett törzsek, genetikailag jellemzett, beoltáshoz kevés antigén - ellenanyagtermelő hibridsejtek kinyerésének hatásfokát befolyásolja: a) immunizálás módja (adjuváns, oltás helye:IP, talp, farokvéna, lép) b) emlékeztető oltások száma c) utolsó oltás és a fúzió között eltelt napok száma (2-4 nap) 2. A fúziós partnerek - BALB/c egérből származó Sp2/0-Ag14 tetraploid, ellenanyagtermelő képességgel nem rendelkező plazmacitoma sejt (anyagcseredefektussal rendelkezik, HGPRT (hipoxantin-guanin- foszforibozil-transzferáz és Timidin Kináz hiány)

8 Monoklonális ellenenyagok felhasználási lehetőségei
Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével Sejtek elválasztása CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) Komplex antigén keverékek analizálása Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

9 Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek?
Az emberi antigénekkel immunizált egérben termelt antitestek az egérre specifikus aminosav-szekvenciákkal bíró glikoproteineket jelentenek, tehát emberbe adva fajidegen fehérjeként hatékony immunválaszt indukálnak. Hogyan kerülhető meg a probléma?

10 A monoklonális antitestek fejlődése
Egér Humán Antigén kötő régió Homológ régió Kiméra Humanizált The participation in regulatory review allows the researcher reviewer a reality check for the real regulatory impact of the MOA data

11 Monoklonális ellenanyagok „humanizálása”
1. CAMPATH-1H anti-CD52 monoklonális patkány ellenanyag Fajidegen ellenanyagok többszöri használata erős immunválaszt indukál. (Probléma: HAMA = humán anti-mouse antitestek) Ha a patkány immunglobulin antigénkötő régiójával cserélik ki egy humán ellenanyag homológ régióját, az így a keletkező ellenanyagban csak az antigénkötő régió lesz patkány eredetű. (Kiméra) (Probléma: HACA = humán anti-chimera antitestek, bár ezek kevésbé immunogének) 2. In vitro fág display: átrendeződött VDJ régiókat filamentózus fágok kapszidjának felszínén fejezik ki, majd a nagy affinitással kötődő fágokat antigén-affinitás oszlopkromatográfiával tisztítják. A fágból izolált humán Ig kódoló DNS-t transzgenikus egerekben expresszáltatják. 3. Olyan knock-out egerekben amelyekben az egér saját Ig génjét inaktiválták a humán „germ-line” (még at nem rendeződött) lokusz transzgénként kifejezhető. Így az egérben játszódik le a humán Ig gének átrendeződése és a humán Ig által „megmentett” egér B-sejtek antigének általi szelekciója. Az egér B-sejtekből amelyek human Ig-t termelnek hibridóma készíthető és nagy mennyiségű Ig állítható elő.

12 In vitro fág display Expresszált humán antitest
Antitestet kódoló humán gének Átrendeződött VDJ gén Fág által kifejezett antitestek (Humán Ig-t kódoló DNS-t szeparálják, transzgén egérben termeltetik) Fág display vektor Gene3 Szelektív kötődés az antigénhez Amplifikálás Mosás

13 transzgén egér (humán Ig kódoló gének bejuttatása)
egér Ig „knock-out”, transzgén egér (humán Ig kódoló gének bejuttatása) VDJ átrendeződés a transzgén egérben

14 Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok
- Tumorterápia Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!) Immunszuppresszió Sejttípusra célzott immunszuppresszió lehetősége

15 Terápiás monoklonális antitestek elnevezése
A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel (nem igényel tulajdonjogot) illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg. A nevezéktan részei: Például:Abciximabab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.

16 Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában
„Naked MAb”, nem konjugált antitest Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphoma Anti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3. vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben) Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumor Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!) Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) 2. konjugált antitest Anti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin) Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

17 Immunszuppresszív ellenanyagok 1.
Anti-TNF-α antitestek infliximab (Remicade): 1998 óta, kiméra adalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje, TNF-α receptor + Ig Fc-vég (Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!) Anti-TNF-α terápia indikációi: Rheumatoid arthritis Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica Crohn-betegség, colitis ulcerosa (általában - még - nem 1. vonal!)

18 Immunszuppresszív ellenanyagok 2.
Muromonab-CD3 (OKT-3) egér IgG2a CD3 pan-T sejt antigén ellen, szervátültetést megelőzően vagy követően alkalmazott immunszupresszív kezelésre; ma már ritkán használják (fajidegen fehérje!); humanizált változatával I-es típusú diabetes mellitusban folynak vizsgálatok Omalizumab (Xolair): IgE elleni humanizált IgG1k monoklonális antitest Ind.: allergiás asthma, Churg-Strauss szindróma Daclizumab (Zenapax): IL-2 receptor elleni, humanizált antitest. Ind.: transzplantációt követően kilökődési reakció ellen, T-limfocita aktivitás gátlására basiliximab (Simulect): mint daclizumab, de kiméra! efalizumab (Raptiva): anti-CD11a, humanizált, ind.: psoriasis

19 Regisztrált molekulárisan irányított szerek
Név Típus Támadás-pont Indikáció Alemtuzumab (Mabcampath) Daclizumab (Zenapax) Basiliximab (Simulect) Rituximab (Rituxan/Mabthera) Trastuzumab (Herceptin) Gemtuzumab Ibritumomab (Y90) Edrecolomab Gefitinib Imatinib Monoclonal antibody, humanized Monoclonal IgG1, chimeric Monoclonal IgG1, humanized Monoclonal IgG4, humanized Calicheamicinnel konjugált Monoclonal IgG1, murine Monoclonal IgG2, murine EGFR-TKI KIT-TKI CD52 IL-2 R CD20 HER2/neu CD33 EpCAM EGFR TK TK CLL, CML rák, leukemia rák, lymphoma emlő-, prosztatarák, NSCLC CRC NSCLC GIST, CML

20 További lehetőségek monoklonális ellenanyagok felhasználására
Radio-immunotherápia Pl. Zevalin, Bexxar – monoklonális + izotóp Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) Az antitesthez enzimet kötnek, mely a később szisztémásan bevitt, ártalmatlan prodrug vegyületet lokálisan alakítja a citotoxikus, hatékony metabolittá Immuno-liposzómák Liposzómába csomagolt nukleotidok vagy gyógyszer célzása monoklonális antitestekkel (pl. tumorszuppresszor gének bevitele, szövetspecifikus génbevitel) Nem immunológiai célpontú manipulációk pl. abciximab (ReoPro): thrombocyta-aggregatio gátlása