Szabályozás Transzkripció, transzláció, enzimaktivitás, fehérje koncentráció, efektor molekulák.

Az előadások a következő témára: "Szabályozás Transzkripció, transzláció, enzimaktivitás, fehérje koncentráció, efektor molekulák."— Előadás másolata:

1 Szabályozás Transzkripció, transzláció, enzimaktivitás, fehérje koncentráció, efektor molekulák

2 Szabályozó útvonalak prokariótákban

3 A szabályozás elsődlegesen a transzkripciónál
A prokarióta gének operonokba szerveződnek A gének megnyilvánulását promóterek vezérlik

4 A DNS függő RNS polimeráz (RNAP) felismeri a promótert és elkezdi a transzkripciót
Iniciáció RNS polimeráz (core enzim) + szigma faktor (sokféle; specifikusság)

5 Az mRNS transzkriptum szinézise (5’3’); komplementere a templát szálnak– szigma disszociál
Elongáció

6 Az elongáció addíg folytatódik, míg az RNAP el nem éri a terminátort és disszociál

7 A transzkripció iniciáció: a RNAP holoenzim a promoterhez kapcsolódik
holoenzim = RNAP core + σ faktor

8 A vegetatív (s70) promóter felépítése
-a core promótert ismeri fel a σ faktor T T G A C A T A T A A T 17 bp spacer (43) % gyakoriság A 47 -60 UP Element DSR -35 -10 +1 Core Promoter

9 Az iniciációs komplextől az elongációsig
RNAP + RNAP RNAP RNAP Zárt komplex Nyitott komplex Elongációs komplex promóter

10 A transzkripció iniciáció mechanizmusa
NTP-ék k1 k2 k3 k4 R + P RPC RPO RPI RPE Ez az átmenet a “promoter clearance” a promóter felszabadulása - kIV k-1 k-2 k-3 A KI egyensúlyi konstanssal írható le KI = RPC/(R + P) abortív transzkriptumok A nyitott komplex képződés sebességét gyakran kII konstanssal R – RNAP P – Promóter RPC – zárt komplex RPO – nyitott komplex RPI – iniciációs komplex RPE- elongációs komplex

11 A transzkripciós ciklus
Körfolyamatnak tekinthető iniciáció elongáció termináció

12 A Thermus aquaticus RNAP core enzim 3D szerkezete (ribbon diagram)

13 Mitől függ a gén transzkripciós aktivitása?
Promóter erősség Mennyire hasonlítanak a promóter fő részei (-10,-35 boxok és a köztük levő távolság) a konszenzus szekvenciához? - általában minél inkább, annál aktívabb a promóter - de néhány hely sokkal fontosabb, mint a többi TTGACA ---17bp---TATAAT---A konszenzus TCGACA---17bp---TATTAT---A erős promóter TCAGTT---19bp---GATAAC---A gyenge promóter

14 A fő elemeken kívüli szekvenciák befolyásolják
a promóter erősségét Néhány promóternél hosszabb –10-es szekvenciák (cisz) 2. UP elemek más promótereknél a -35-ös boksz előtti AT gazdag szekvenciák növelik a transzkripció sebességét (cisz) 3. Downstream elemek közvetlenül a transzkripciós start hely utáni szekvenciák befolyásolhatják a transzkripció iniciációjának hatékonyságát (cisz) Szabályozó fehérjék, vagy más effektor molekulák (transz)

15 Génszabályozás I – Transzkripció szabályozása
NTP-k k1 k2 k3 k4 R + P RPC RPO RPI RPE Ez az átmenet a „promóter tisztulása,” “promoter clearance”, a kIV konstanssal jellemezhető k-1 k-2 k-3 abortív transzkriptumok A KI egyensúlyi konstanssal jellemezhető KI = RPC/(R + P) A nyitott komplex képződés sebessége kII

16 Szabályozó fehérjék – általában DNS-kötő fehérjék
Két lépés a szabályozott gén-megnyilvánuláshoz 1. σ faktor választék – megszabja, hogy melyik promoter legyen be-, vagy kikapcsolva. Szabályozó fehérjék – általában DNS-kötő fehérjék a. Represszorok – gátolják a transzkripciót b. Aktivátorok – növelik a transzkripciót c. Kettős hatású szabályozók – mindkettőt – a körülményektől függően

17 A transzkripció inicációjának kezdete: RNAP holoenzim kötődik a promóterhez
holoenzim = RNAP core (α2ββ’) + σ

18 A vegetatív (s70) promóter felépítése
-a core promótert ismeri fel a σ faktor T T G A C A T A T A A T 17 bp spacer (43) % gyakoriság A 47 -60 UP elemek DSR -35 -10 +1 Core promóter DSR = downstream regulátor elemek

19 Alternatív σ faktorok Különböző szerkezetű promótereket ismernek föl – gének különböző regulonjai

20 Az különböző σ faktorral szabályozott promótereknek teljesen eltérő konszenzus szekvenciája lehet
s70 TTGACA – 17 bp – TATAATN3-6-A s CTTGAAA – 16 bp – CCCCATNTN3-10-T/A s GG – N12 – GC/T – 12bp – A

21 Egy adott pillanatban a legtöbb RNAP s70 –es, de néhány százalékban más σ faktor is van

22 A legtöbb s faktor a s70 –es családhoz tartozik és ezért a σ70 –hez hasonlóan működik
A s54 eltérő – a kötödés után egy aktívátor fehérjének kell aktiválni – kII–őt befolyásolja – RPO képződik

23 Hogyan tudja egy anti-σ faktor a diferenciális génszabályozást biztosítani?
Példa: egy anti-σ faktor az FlgM (FlgM – s28)

24 Transzkripciós faktorok
Általában DNS-kötő fehérjék, amelyek asszociálnak a szabályozott promóterrel és csökkentik, vagy növelik a transzkripció gyakoriságát. Represszorok és aktívátorok –a szabályozó fehérjék jó része mindkettőt tudja a körülményektől függően

25 A represszorok eltérő szabályozási mintázatokat juttathatnak érvényre
Arginin bioszintézis Laktóz degradáció Represszió Indukció

26 A represszió, vagy korepresszió mechanizmusa
Példa: arginin, a 20 aminosav egyike A baktériumok el tudják készíteni maguknak, de ha arginint adunk a táptalajhoz, nem működtetik a bioszintézis géneket (nem nyilvánulnak meg) (A fene se dolgozik, ha van kaja bőven!) Nincs arginin Kell a sejtnek A represszor nem kötődik Az arginin gének megnyilvánulnak Sok az arginin Elegendő a sejtnek Represszor + Arg kötődik Az arginin gének csendesek Arginin Represszor, korepresszor, effektor, operátor

27 Egy indukálható repressziós mechanizmus
Példa: laktóz, cukor szénforrás a baktériumok hasznosítani fogják a laktózt, ha az van a tápközegben, de nem működtetik az ehhez szükséges géneket, ha nincs (Miért gyártsuk le az enzimeket, ha nincs is laktóz?) Nincs laktóz A sejt nem hasznosíthatja A represszor kötődik a lac operátorhoz Lac enzimek nem képződnek Van laktóz Tápanyagként hasznosíthatják [Represszor + allolaktóz] leválik a DNS-ről A Lac enzimek gyártása elkezdődhet Lactose

28 A transzkripciót aktíváló mechanizmus
Példa: maltóz, cukor szénforrás A baktériumok hasznosítják a maltózt, ha van, de a gének nem nyilvánulnak meg, ha nincs (Miért készítsük el a maltóz hasznosításához szükséges enzimeket, ha nincs a környezetünkben? – a lac-hoz hasonló logika) Van maltóz Tápanyagként hasznosíthatják a sejtek [Aktívátor+maltóz] kötődhet a DNS-hez Készülnek a Mal enzimek Nincs maltóz A sejtek nem Az aktívátor nem kötődhet a DNS-hez Nincs Mal enzim szintézis Gyenge promóter maltóz Aktívátor fehérje, iducer, aktívátor-kötő hely

29 Hova kötődnek a szabályozó fehérjék a promótereknél?
Az aktívátorok általában -30-as hely előtt (upstream) kötődnek; míg sok represszor utána (downstream), valamint a -30-as boksz előtt is kapcsolódhat a DNS-hez

30 Represszió, gátló mechanizmusok
Térbeli gátlás (steric hindrance) – a kötőhely átfed a promóterrel és és a represszor kötődés affinitása nagyobb, mint a RNAP-é (KI) Fehérje-fehérje kölcsönhatások – a represszor megakadályozza a RNAP kötődése utáni lépéseket (kII és kIV) RNS polimeráz bezárása – a represszor megváltoztatja a lokális DNS szerkezetet és így limitálja a kötődött RNAP produktivitását (kII és kIV) Összetett (multipartite) promóterek és DNS kihurkolás (DNA looping) – összetett represszorok kötődnek különböző helyeknél, megváltoztatva a DNS konformációját és befolyásolják a RNAP kötődését (KI)

31 A l represszor térbeli gátlással akadályozza PR aktivitását
Lítikus funkciók -10 -35 -35 -10 Lizogén funkciók OR3 OR2 OR1 PRM PR

32 A legtöbb represszor sokkal komplikáltabb – a LacI represszor is
Az összetett operátorok és a DNS looping is gyakori További fehérjék (mint pl. a CAP és a CytR) is gyakran szerepelnek

33 A transzkripció aktíválásának néhány mechanizmusa
Szinte mindig szükséges a RNAP-al való kontaktus Nagyon jó példa a katabolit represszió – a katabolit aktivátor fehérje (catabolite activator protein) (CAP) Ez „globális” szabályozó – több mint 100 promótert szabályoz

34 II. – átfeda –35–ös régióval
A CAP a cAMP-vel kapcsolódva aktíválódik (cAMP intracelluláris koncentrációja nő, ha a glükóz elfogy) A fehérje dimerizálódik és különböző módon kötődhet a promóterekhez – és nagy mértékben meghajlítja a DNS-t (DNA bending) I. – a -35 box előtt II. – átfeda –35–ös régióval A RNAP-pal érintkezve stimulálja a transzkripciót Class I Class II

35 A promóter aktíválás I. és a II csoportjának modelljei
Az I. csoportban a CAP kötőhelyek -62-től -103-ig terjedhetnek. A CAP a RNAP α-alegységének C-terminális (αCTD) részével lép kölcsönhatásba A II. csoportban a CAP kötőhelye általában átfed a -35-ös régióval. A CAP kölcsönhat az aCTD-vel, aNTD-velés a s faktorral is

36 Az AraC szükséges az ara gének aktíválásához
További adatok szerint az AraC kapcsolódik egy a PBAD promótere (az araBAD gének promótere) előtti távoli araO2 operátorhoz és ekkor gátolja a PBAD aktivitását.

37 Regulátorok aktívátor és represszor aktivitással
Az arabinóz katabolizmus regulátora az AraC jó példa erre Sok gén vesz részt a felvételében és a katabolizmusában

38 Az AraC-től függő szabályozás
Összetett repressziós loop Transzkripciós aktívátor I. csoport araC-PBAD kazetta kereskedelmi forgalomban Szigorú represszió arabinóz nélkül (és glükóz jelenlétében) 2. Arabinóz hozzáadásával erős aktíválódás

39 A s54 –től függő aktíválás mechanizmusa
( a jó öreg σ) Az NtrC transzkripciós aktívátorral való kölcsönhatással – egy enhancer típusú fehérje NtrC stimulálja a s54 RPO képződést – így befolyásolja kII-őt

40 A regulátorok a RNAP különböző komponenseivel lépnek kölcsönhatásba

41 Szabályozási útvonalak prokariótákban

42 A transzkripció terminációja a szabályozás fontos célpontja lehet

43 A transzkripció sok gén esetében a kódoló szekvenciák után fejeződik be

44 A trp mRNS upstream regiójának több lehetséges másodlagos szerkezete lehet, az egyik transzkripiós terminátor

45 A triptofán bioszintézise többszörösen szabályozott
- Egyszerű korepressziós mechanizmus a triptofánra adott válasz – a regulátor a TrpR triptofán + TrpR TrpR Genotípus trpEDCBA expresszió - Trp Trp WT +++++ -/+ trpR mutáns +++ A trp operon expressziója – trpEDCBA A trpR null mutánsban a trp gének nem működnek konstitutívan. Van valamennyi triptofán represszió.

46 A gén szekvenciájának elemzése érdekes tulajdonságot fedett fel
Ennek a szekvenciának a deléciója megszüntette a TrpR-től független repressziót

47 A transzkripció attenuációjának mechanizmusa
RNAP megpihen az 1:2 hajtű szintézise után 2a. A riboszóma elkezdi a leader transzlációját – áthalad a Trp kodonokon (sok Trp) 2b. A riboszóma elkezdi a leader transzlációját – a Trp kodonoknál megáll (kevés a Trp) 3a. A riboszóma befejezi a leader peptidet – a 3:4 hajtű kialakul 3b. Az álló riboszóma megakadályozza 1:2 kialakulását – helyette 2:3 képződik 4a. A RNAP terminációját a 3:4 hajtű kialakulása okozza 4b. A 3:4 hajtű nem tud idejében kialakulni, a RNAP átírja a lehetséges terminátor helyet

48 A transzláció attenuációja
Gyakran az antibiotikum rezisztencia géneknél – néhány antibiotikum célpontja a riboszóma. Egy egyedi mRNS szerkezeten és egy leader peptiden alapul

49 mRNS másodlagos szerkezete lefedi a riboszóma-kötő helyet
A transzláció várakozása a vezető-peptidnél megtöri a másodlagos szerkezetet és lehetővé teszi a transzlációt

50 A fehérje funkció szabályozása a stabilitásával
Proteázok befolyásolhatják a fehérje aktivitásának szabályozását

51 Példa: A sS faktor stabilitásának szabályozása
Az RssB fehérje versenyez a sS –ért és kijelöli lebontásra

52 Adaptáció környezeti változásra adott válaszként
Külső jelek Transzmembrán receptor Indirekt hatás Belső jelek Membránon áthatoló jelek Fiziológiai változás Génszabályozás

53 A környezeti jelzés egyszerű paradigmája – a két komponensű rendszer
> 30 ilyen rendszer az E. coli-ban – növényekben és gombákban is, nem csak baktériumokban 1. Környezetből jel (signal) 2. Érzékelő kináz (sensor kinase) 3. Válasz szabályozó (response regulator)

54 A két komponensű jelátvivő rendszer egyszerűsített modellje (two component-regulatory system)
Az értékelő hisztidin kináz (sensor histidine kinase) (HK) – általában transzmembrán fehérje – foszforilezi saját magát (autofoszforiláció) A válasz szabályozó (response regulator) (RR) – gyakran, de nem mindig, hat a génexpresszióra – a HK foszforilezi (phosphorelay)

55 A foszfotranszfer reakciók alaplépései
Autofoszforiláció: HK-His + ATP HK-His~P +ADP Foszfotranszfer: HK-His~P + RR-Asp HK-HIs + RR-Asp~P Defoszforiláció: RR-Asp~P + H20RR-Asp + Pi Alternatív mechanizmusok 1. HK foszfatázok: HK-His~P + PPHK-His + Pi 2. RR foszfatázok: RR-Asp~P + PP RR-Asp + Pi

56 Változatos fizikai és kémiai stimulusokra válasz lehetőség
Az alap téma változatos variációi léteznek és minél többet vizsgáljuk, annál több permutációját figyelhetjük meg.

57 A kétkomponensű RR-ek szerkezetének vizsgálata szerint jól konzerválódott modul rendszerű felépítés
Che B metilészteráz NarL RR CheA hisztidin kináz

58 Hogyan reagálnak a megfelelő szignálra?
E tekintetben mind különböző A szenzor azon része, ami lehetővé teszi a szignálra adott választ nagyon különbözik az egyes fehérjékben

59 Egy jól ismert szignál transzdukciós rendszer
(N2-kötés) L A Rhizobium FixL-FixJ rendszer szabályozza a gének válaszát a molekuláris oxigénre A FixL észleli a hem csoportjához kötődő oxigént a sejt belsejében A FixJ~P aktíválja a célgéneket, ha kicsi az O2 koncentráció O2 Hem P His J J P Asp

60 Az RssB is egy RR típusú fehérje
HK, ha van egyáltalán, nincs azonosítva. A célfunkció a proteolízis.

61 A két komponens nem elég – phosphorelay, foszfát továbbítás

62

63 Phosphorelay szabályozza a B. subtilis spórázását

64 Egy kettős kináz, phosphorelay szabályozza a Vibrio harveyi fénytermelését

65 Eukarióta kétkomponensű rendszerek

66 Mikrobiális differenciálódás
Definíciók Két sejt különbözik egymástól abban a tekintetben, hogy bár genomjuk azonos, a szintetizálódó fehérjék különböznek. (Jacob and Monod, 1963) A differenciálódás a sejtek alakjában és funkciójában végbemenő stabil, vagy metastabil változás, amikor is a változás a sejt normális életciklusának a része. (Marty Dworkin, 1985) A prokarióta differenciálódáshoz olyan, az alaki és funkcióbeli változások szükségesek, amelyek kiemelkedő szerepet játszanak az organizmus életciklusában. (Brun and Shimkets, 2000)

67 Myxobacterium-ok: a fruiting body (termő-test) képződés komplexitása.

68 A Myxobacterium-ok termő-testjei baktérium sejtek ezreinek aggregátumából állnak
érett aggregátum fiatal aggregátum

69 Caulobacter crescentus, mint a sejtdifferenciálódás modellje
Kirajzó (swarmer) sejt: szóródás - Nincs DNS replikáció - Nincs sejtosztódás - Mozgékony (motilis) Kocsányos (stalked) sejt: reprodukció - DNS replikáció - Sejtosztódás - Felülethez kapcsolva

70 A Caulobacter életciklusa
kirajzás horgony szintézis Undergoes cellular differentiation--predivisional cell has two types of cell poles The holdfast appears during the swarmer to stalked cell differentiation The holdfast is made at a specific time in a specific place, but it’s unclear how this spatial and temporal regulation is achieved. composed in part of complex polysaccharides, namely N-acetylglactosamine and N-acetylglucosamine (may also have acidic components but proteolic enzymes don’t seem to have an affect the holdfast mediates attachment to substrates in the environment allowing Caulobacter’s stalked cells to live a sessile life lehorgonyzás

71 Az úszó-sejt differenciálódás komplex programja

72 Az endospóra képződés mint fejlődési modell
Spóraképző baktériumok (pl. Bacillus, Clostridium, Myxococcus) A baktérium sejtben képződik, ezért „endo”-spóra A baktérium sejtciklus nyugvó fázisa Képződése rendszerint valamilyen környezeti hatásra, mint az éhezés, indukálódik Nagyon ellenálló - meleg, hideg, kiszáradás, UV sugárzás spórák

73 Spórázás

74 A Bacillus endospóra modell rendszer
DNS-SASP komplex dipikolinsav SASP: small acid soluble proteins

75 Az endospóra képződésének diszkrét fejlődési állomásai

76 Előspóra képződés az anyasejtben

77 Végül a spóra kiszabadul, az anyasejt lizál

78 Spóra csírázás Kedvező környezetben a spóra kicsírázik és visszatér a vegetatív szaporodáshoz. vegetatív sejt spóra

79 A spórázáshoz szükséges gének
Összességében több mint 100 gén spo gének - > 50 különböző gén – spórázáskor nyilvánulnak meg ger gének – a csírázáskor megnyilvánuló specifikus gének más gének – számos gén szükséges még spórázáskor/csírázáskor, ezek természetesen máskor is szükségesek

80 A spo géneket aszerint nevezték el, hogy a spórázás melyik fejlődési szakaszában nyilvánult meg a hibájuk

81 A B. subtilis különböző szempotok figyelembevételével dönt a spórázásról
Végül mind a SpoOA fehérje foszforilezében nyilvánul meg

82 A SpoOA~P különböző géneket aktívál és represszál, amelyek a spórázás iniciációjához kellenek
Az elsődleges célpontok közül kettő σ faktor

83 A SpoOA~P s factor kaszkádot indít el
- Számos szabályozási célpont, a σ-ák is, kompartment-specifikusak sA – vegetatív, sH – korai spórázás, sF előspóra, sE – anyasejt, sG, elkülönült spóra, sK – pusztuló anyasejt

84 A sF és a sE mindkét kompartmentben anyasejt specifikus szigma faktorok
sF aktíváláshoz kellenek: anti-s faktor és anti-anti-s faktor

85 A sE aktíválásához a pre-protein proteolitikus hasítása kell
sE érését az előspórában lévő sF aktíválja

86 A kompartmentek közötti criss-cross kommunikáció spórázáskor
Az anyasejt-specifikus s faktorok pre-proteinként képződnek, aktíválásukhoz utómunkálatok szükségesek. Az előspóra-specifikus s faktorokat anti/anti-anti s faktor rendszerek szabályozzák

87 A kromoszóma DNS partíciója alapvetően különbözik a vegetatív szaporodási mechanizmustól

88 A DNS és a fehérjék elhelyezkedése spórázáskor
SpoIIE A konjugációs transzfer rendszerekhez hasonló

89 B. subtilis spórázás: szabályozó kölcsönhatások
A gének, fehérjék és kis molekulák különböző kölcsönhatása kell a spórázás iniciációjához. SinR~SinI SinI inaktíváljaSinR-t AbrB - AbrB represszálja sin operont sinR  A H sinI SinR SinI sin operon Spo0A˜P + Spo0A~P aktíválja sin operont

90 Spórázás iniciáció: szabályozó hálózat B. subtilis-ban
protein gene promoter kinA - +  H KinA phospho- relay Spo0A˜P Spo0A A spo0A sinR sinI SinI SinR SinR/SinI sigF hpr (scoR) abrB Hpr AbrB spo0E sigH (spo0H) Spo0E F Signal

91 EUKARIÓTA GÉNEXPRESSZIÓ

92 A TRANSZKRIPCIÓ SZABÁLYOZÁSA

93 EUKARIÓTA RNS POLIMERÁZOK
VÁLTOZÓ 10 % kis RNS (tRNS & 5S rRNS) NUCLEOPLASMA POL III + 20-40 % mRNS POL II - 50-70 % rRNS NUCLEOLOUS POL I a AMANITIN ÉRZÉKENYSÉG RELATÍV AKTIVITÁS TERMÉK HELY TÍPUS

94 RNS POLIMERÁZOK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
E. coli a2bb’ EUKARIÓTA I II III L’ L L’ L L’ L b b’ ~ b és b’ CTD a a’ ~ a és a’ KÖZÖS

95 POL II transzkripció iniciáció
POL II-őn kívül még + 7 GTF (GENERAL TRANSCRIPTION FACTORS) A GTF-ek: TFIIA, IIB, IID, IIE, IIF, IIH & IIJ

96 Transzkripció INICIÁCIÓ - RNS polimeráz kötödése
- DNS lokális kitekerése ELONGÁCIÓ - Komplementer bázispárosítás - foszfodiészter kötések kialakítása - 5’ → 3’ transzlokáció TERMINÁCIÓ - nem specifikus és rosszul meghatározott

97 POL II RNS szintézis DNS templátról
Az iniciáció és az elongáció során egy sor általános és specifikus transzkripciós faktorral lép kölcsönhatásba 8-12 alegységből épül fel Méreteik változóak 240→16 kDa

98 POL II alegységek

99 POL II nagy 240KD-os alegysége
E coli b’-höz hasonló Nagyon konzerválódott – ember/egér 95% C terminális ismétlődő CTD TYR SER PRO THR SER PRO SER 52X egérben 26X élesztőben CTD esszenciális az életképességhez

100 140 KD-os alegység E coli b - hoz hasonlít
A H1hisztonnal keresztreagál

101 SOKLÉPCSŐS MODELL PRE-INICIÁCIÓS KOMPLEX
H J E POL II IIF CTD IIA IIB IID INR TATA UPE -20 +1

102 SOKLÉPCSŐS MODELL INICIÁCIÓS KOMPLEX CTD foszforiláció
ATP IID IIA IIB H J E POL II IIF CTD INR TATA UPE -20 +1 P P P P

103 SOKLÉPCSŐS MODELL PROMÓTER CLEARANCE
RIBONUCLEOTIDES pre-mRNA H J E POL II IIA IIB IID INR TATA UPE -20 +1 P P P P ELONGATION FACTORS CTD

104 INICIÁCIÓ

105 PROMÓTER CLEARANCE

106 ELONGÁCIÓ

107 HOLOENZIM

108 HOLOENZYME

109 HOLOENZIM KOMPLEX ELŐSZERELT
POL II IIF CTD H J IIB E IIA IID UPE TATA INR -20 +1

110 HOLOENZIM KOMPLEX ELŐSZERELT
POL II IIF CTD H J IIB IIA IID UPE TATA INR -20 +1

111 VÁLTOZÁSOK AZ EXPRESSZÁLÓDÓ CHROMATINBAN
DNAase I ÉRZÉKENSÉG DNAase I HIPERÉRZÉKENYSÉG (kibomlik) DEMETILÁLÓDÁS (RE érzékenység: MspI (Met), HpaII) aktív gének gyengén metiláltak HISZTONOK ACETILEZÉSE (C-terminális vég lizinben gazdag, acetilezés semlegesíti, csökkenő kötődés)

112 CHROMATIN ALAPEGYSÉG = NUKLEOSZÓMA 200 bp DNS H2A H2A H1 H2B H2B H1 H3

113 BIZONYÍTÉK A NUKLOSZÓMÁRA
CHROMATIN-t Micricoccus nukleázzal emésztve 200 bp-os „létrát” kapunk 2OO 6OO 4OO 8OO 10OO

114 EUKARIÓTA PROMÓTER TATA Inr -100 -30 Py2CAPy5
UPSTREAM PROMOTER ELEMENTS (UPEs) TATA Inr -100 -30 Py2CAPy5 Iniciáció általában egy A -nál

115 POL I, POL II ÉS POL III PROMÓTEREK
AdML UPE -60 TATA -30 Inr +1 POL III tRNA (internal) A +20 B +60 tRNA PSE -60 TATA -30 POL I rRNA UCE -90 CORE

116 POL I, POL II ÉS POL III PROMÓTEREK
Minden promóterhez kell a TFIID TATA kötő helye

117 Hogyan vizsgáljuk a promótereket?
Klónozzuk a gén 5’ végét és keressük a konzerválódott motívumokat Megkeressük a fehérjéhez kötödő DNS szekvenciákat: band shifts, footprinting Funkcionális vizsgálatok: helyspecifikus mutagenezis, riporter gén

118 Upstream elemek, enhancerek, silencerek
Tipikus pol II: Eukarióta promóterek:

119 Transzkripciós aktivátorok
HTH motívum HLH motívum Zinc-finger

120 Transzkripciós aktivátorok
Leucin-zipper:

121 Példa: zinc finger, élesztő GAL4, GAL80
Galaktóz indukál

122 Transzkripció után: RNS splicing

123 RNS érés mechanizmusa Splicing szignálok:
5' - AG|GUAAGU – intron –YNCURAC – YnNAG|G - 3'

124 Splicosome

125 Alternatív splicing

126 Self-splicing intronok: I., II. csoport
I. csoport rRNS prekurzorok:

127 Self-splicing intronok: I., II. csoport
II. csoprt mitokondrium és kloroplaszt génekben:

128 5’sapka és 3’poliA farok

129 5’ sapka: RNS stabilitás

130 3’ polA farok: RNS stabilitás
Poliadenilációs szignál : AAUAAA

131 Rövidítés Teljes név Funkció CPSF cleavage and polyadenylation specificity factor hasításhoz, adenilációhoz is kell, köt a AAUAAA-hoz CF-I cleavage factor I RNS kötő fehérje, csak a hasításhoz kell CF-II cleavage factor II csak a hasításhoz kell CstF cleavage stimulation factor csak hasításhoz kell, a GU/U régióhoz köt PAP poly [A] polymerase poli [A] szintézist katalizálja és a hasításhoz is PAB II pol [A] binding protein II poliadenilációt stimulálja, segíti poli [A] farok növekedését

132 CPSF kék, CF I és II barna, CstF szürke
PAP piros PAB II sárga

133 MÁS: Transzlációs frameshifting

134

135 Transzlációs bypass: T4 gene 60 (topoizomeráz)

136 INTEIN, EXTEIN

137

138

139