Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária

Az előadások a következő témára: "Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária"— Előadás másolata:

1 Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária
A humán genom projekt 2.

2 Hogyan találjuk meg a géneket?
A “hasznos információ” - hány génünk van? Kb. 40, ,000 fehérje kódoló gén (sokkal kevesebb, mint amennyit vártunk) vagyis a gének a genom kevesebb mint 5%-át foglalják el….. Hogyan találjuk meg a géneket?

3 Rövid másolatok (150 -400 bp) PCR reakcióval:
Gén = az az információ, amely az egyes szövetekben kifejeződik (expresszálódik) Kiindulási pont: Az agy (és más szövetek) mRNS információtartalma (cDNS) Rövid másolatok ( bp) PCR reakcióval: Craig Venter Random primer

4 EST = expressed sequence tag
Olyan rövid DNS szekvencia részletek, melyek kifejeződnek (az agyban ill. máshol) EST könyvtár Az agyban (ill. más szövetekben) kifejeződő gének azonosítására alkalmas

5 2. Hol van az EST a humán genomban? ‘in silico’ keresés
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool 1. EST -k szekvenálása 2375 agyi EST szekvenálása + BLAST 3. Gének azonosítása, új gének felfedezése < 400 ismert gén Közel 2000 új gén felfedezése

6 Celera, 2001: kb. 30 000 EST kb. 35 000 humán gén
A gének könyve

7 Gének azonosítása ‘in silico’
Mi jellemző a génre: 1. Start jel (start kodon) 2. Stop jel (stop kodonok) NE LEGYENEK SŰRŰN! 3. Exon/intron átmenet: jellemző szekvenciák Kereső programok pl. ORF (NBCI)

8 ORF= open reading frame =„Olvasási keret”
1 2 3 GTGCGTGAGC GTGGCCACCG AGCGCGCCCT GCAGACGCCC ACCAACTCCT TCATCGTGAG CCTGGCGGCC GCCGACCTCC TCCTCGCTCT CCTGGTGCTG CCGCTCTTCG TCTACTCCGA GGTGAGCCGC GTCCGGCCGC ACGAGCATCC TCACCTGCTC 6 5 4

9 NCBI ORF finder: „Olvasási keret kereső”

10 Transzkripciós faktorok
5’ nem kódoló régió 1 kódoló régió promoter DNS TATA GC GT DNS-dep. RNS-pol. II. Transzkr. F. (FEHÉRJÉK) enhancer / silencer szekvenciák Zn2+ Y C F L H ... Sp1 TATA-box: TATA A A T GC-box: GGGGCGGGG GT/CACC-box: GGTGTGGG TATA GC GT

11 DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálat Gél retardáció
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

12 * * EMSA Hagyományos elektroforézis START DNS-fehérje komplex Szabad
DNS darab (jelölt oligo) *

13 * * EMSA Kapilláris elektroforézis gyorsabb lassabb 2 4 6 8 perc
DNS-fehérje komplex * Szabad DNS darab (jelölt oligo) * gyorsabb lassabb 2 4 6 8 perc

14 Specifikus-e a DNS-fehérje kötődés ?
Kompetíciós (versengési) kísérletek A jelölt oligo a „próba” „vad típusú próba” 5’– F –CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’ „specifikus kompetitor” A nem jelölt oligo a „kompetitor” 5’–CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’ „nem-specifikus (mutáns) kompetitor” 5’–CCCTTGGTGGGTTGGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCAACCCCGGGATTCGACGC–5’

15 EMSA: A specifikus kötődés igazolása
Spec. Komp. + + Nem spec. komp. 1 2 3 DNS- fehérje komplex látjuk 3 nem látjuk 2

16 EMSA: A specifikus kötődés igazolása: supershift
ellenanyag + + Spec. ellenanyag antipeptid 1 2 3 DNS- fehérje komplex * 3 + még lassabb „supershift” 2

17 Rekombiáns DNS technológia a gyógyszeriparban
Humán rekombináns fehérjék előállítása gyógyászati célra

18 Rekombináns gyógyszerek
tPA trombózis VIII. faktor hemofilia CSF (colony stimulatong factor) immundeficiencia eritropoetin anemia hGF (growth factor) hGF hiány (növekedési rendellenesség) inzulin diabetes interleukin immunodeficiencia VACCINÁK Pl. hepatitis B FEHÉRJÉK ipari előállítása ?

19 Humán génexpresszió Prokariótákban
Expressziós vektorok A humán gén “háziasítása” - csak exonok (cDNS) - bakteriális promoter - bakteriális riboszóma kötőhely Az idegen fehérje expressziójának ki/be kapcsolása Represszor fehérje ProK DNS lac promoter lac operátor Humán fehérje cDNS +IPTG indukció expresszió

20 Inzulin: Az első engedélyezett rekombináns gyógyszer
1. Vektor konstrukció promoter operátor AmpR ori lacZ (b gal) Inzulin A vagy B lánc (inszert) Mesterséges “ inzulin gén” Aminósav szekvencia  bázisszekvencia

21 2. Bakteriális transzformáció, AmpR klónok szelektásása és klónozása
E. coli Bakteriális kromoszóma lac represszor AmpR plazmid 3. Fúziós fehérje termelése IPTG adásra 4. Lízis, fehérje izolálása, tisztítása 6. A és B lánc in vitro egyesítése bgal inzulin 5. CN Br kezelés: Metionin lebomlik, inzulin felszabadul

22 Met-hiányos hGH bakteriális expressziója
1. Vektor konstrukció hGH Bakteriális szignál szekvencia (extracelluláris) AmpR 1. Transzformáció szelekció növesztés 2. hGH szekréció a periplazmás térbe 3. Bakteriális periplazmás proteáz: levágja a szignál szekvenciát 4. Met-nélküli rec hGH tisztítása

23 Riporter gének EuK sejt sejtmag Virus-vektor-riporter gén konstruktum
Expresszió mérés a riporter fehérje alapján Riporter rendszerek luciferáz ATP  ADP + Pi + fény b-galaktozidáz Laktóz analóg  kék színű termék KÉK SEJTEK CAT (kloramfenikol acetil transzferáz)

24 Riporter gének felhasználása
pl. Transzkripciós faktorok (TF) tesztelése riporter 1 2 A vektor B vektor 3 1: enhancer 2: promoter 3: TF génje EuK sejt sejtmag TF

25 Transzgenikus állatok
1982: az óriás egér megtermékenyített petesejt vákum csipesz Növekedési hormon gén injektálása a hím pronukleuszba

26 A transzgenikus állatok elkészítése
1. Mikroinjektálás (több száz petesejt, mikromanipulátor) 2. Beültetés ál-terhes nősténybe 3. Az utódok ellenőrzése (PCR a farokból) 4. Pároztatás 5. Beltenyésztés - Klónozás?

27 A transzgenikus állatok klónozása
A t-PA-t tejelő egér t-PA + lactalbumin szignál szekvencia szövet specifikus promoter szekréció a tejbe: 0.1 mg t-PA/ml tej Jövő: transzgenikus tehén? (JUH, KECSKE) A transzgenikus állatok klónozása Molecular Farming