Mol. biol. módszerek 1. Dr. Sasvári Mária

Az előadások a következő témára: "Mol. biol. módszerek 1. Dr. Sasvári Mária"— Előadás másolata:

1 Mol. biol. módszerek 1. Dr. Sasvári Mária
A humán genom projekt

2 A HGP “munkapéldánya”

3 CeleraGenomics (privát szektor) Craig Venter HGP (Human Genome Project) Francis Collins 20 központ, állami támogatás NCBI:National Center of Biotechnology Information

4 A humán genom első nyers szekvenciája
2001 febr 16 Nature: HGP National Human Genome Research Institute NIH, USA) US Department of Energy Wellcome Trust (Anglia) Japán, Franciaország, Németország, Kina kb millió dollár (fele US támogatásból) 2001 febr 16 Science: Celera

5 A HGP hierarchikus rendszere
Alacsony felbontás Citogenetikai (kromoszómasáv) térképek Átfedő fragmentumok klónozása Restrikciós térképezés Szekvenálás Nagy felbontás

6 (‘unique’) szekvencia
Minden kezdet nehéz J. Watson, a HGP első elnöke Első cél: minél több marker kifejlesztése (átlagos távolság: bp legyen) Marker: Egyszer előfordul ó (‘unique’) szekvencia ( bp) Eredmény: 30000 db marker

7 A hierarchikus rendszer felépítése
Izolált kromoszómák feldarabolása ritkán vágó restrikciós endonukleázokkal bp darabok A keletkezett darabok klónozása  BAC (Bacterial Arteficial Chromosome) könyvtár létrehozása

8 A hierarchikus rendszer felépítése
BAC könyvtár: átfedő darabok Következő lépések: 1. restrikciós térképezés 2. Sorba-rendezés 3. A minimális számú BAC klón kiszelektálása

9 BAC könyvtárból fág könyvtár
kb bp (BAC) kb bp darabok (átfednek) A végek szekvenálása GCCGAATCCAATTAGAAAAT TAGAAAATCACATTTACCAGTCTGA CCAGTCTGACCCCGCAAACGGGTTT A szekvenciák sorba rakása GCCGAATCCAATTAGAAAAT TAGAAAATCACATTTACCAGTCTGA CCAGTCTGACCCCGCAAACGGGTTT

10 Összerakás

11 Celera: A “géppisztoly” módszer
Craig Venter 2000 bp és bp darabok A végek szekvenálása, összerakás: AAGGACTTATG____________________GGACACAGGTTATGG GACTTA_____CGTTGGA GAGAGGACACA________________CGTTATATTG

12 Módszertani áttörések
1992-es adatok a DNS szekvenálásról: 1$/bp, 100,000 bp/év Humán genom 3x109bp: 30,000 év, 3 miliárd dollár ? Módszertani áttörések Automata DNS szekvenálás kifejlesztése Polimeráz láncreakció (PCR) Adatfeldolgozás fejlődése (Bioinformatika)

13 Automata DNS szekvenálás
Nyers szekvencia

14 Az automata DNS szekvenálás elve
‘Színes szekvenálás` A dideoxi lánc termináláson alapul Termináló helyek ... 3’ C A G T A ddA Szekvenáló reakcióelegy: Mind a négy dNTP Mind a négy ddNTP különböző színű fluorogén festékkel DNA polimeráz, primer

15 Egy szekvenálási eredmény:
+ index

16 PCR: Egy kiválasztott DNS szakasz sokszorosítása
A teljes genom bp PCR termék (2 x ) 2 x 3x109 bp dsDNS fragmentum

17

18 A Humán Genom reprezentációs formái:
1. : ‘in silico’ HGP (Human Genome Program) NCBI:National Center of Biotechnology Information

19

20 International Nucleotide Sequence Database Collaboration :
3 fő tagja van: GenBank (NIH, Bethesda, Maryland USA) Európai: EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory) (EMBL's European Bioinformatics Institute, ma Angliában, régebben Heidelbergben) 3. DNA Data Bank of Japan Az adatbázis meghaladta a t 100 x 109 bp faj teljes vagy részleges genomját tartalmazza

21 2000 2005

22

23

24

25

26 A 21-es kromoszómán található gének listája (Entrez/Nucleotides (GenBank)

27 Keresés: DRD4 gén (Entrez/Nucleotides (GenBank)

28 A DRD4 gén (dopamin D4-es receptor) helyzete a 11-es kromoszómán
(Entrez/Nucleotides (GenBank)

29 NCBI / Entrez Gene

30 NCBI / Entrez Gene keresés: DRD4 (humán)

31 NCBI / Entrez Gene keresés: DRD4 (humán)
Exon/intron szerkezet Környező gének publikációk

32 Keresés betegségre: „Hypercholesterolemia”
(Entrez/Nucleotides (GenBank)

33 Keresés betegségre: OMIM Online Mendelian Inheritance in Man

34 OMIM keresés: hypercholesterolemia

35 A Humán Genom reprezentációs formái: 2. : Bakteriális kolóniákban
BAC klónok Minden klónozott darab helye ismert FISH (fluorescent in situ hybridization) Markerek STS (short tagged sequence) Egyedi szekvenciák, klón azonosítók (genom) EST (expressed sequence tag) Egyedi szekvenciák a cDNS könyvtárakból

36 Mit lehet kiolvasni a DNS szekvenciákból?

37 A “hasznos információ” - hány génünk van?
Kb. 20, ,000 fehérje kódoló gén (sokkal kevesebb, mint amennyit vártunk) vagyis a gének a genom kevesebb mint 5%-át foglalják el…..

38

39 ??? ISMÉTLŐDŐ SZEKVENCIÁK
Mi van a maradék 95% „extra (felesleg? szemét?) DNS-ben? ISMÉTLŐDŐ SZEKVENCIÁK ??? A humán genom 45% -át “ugráló gének” (transzpozonok) alkotják LINE (long interspread elements) 6 kb, 8500 kópia, a genom 25%-a reverz transzkripcióval szaporodik nagyon sok sérült (rövidebb, inaktív) példány SINE (short interspred elements) bp, 1,5 millió kópia, a genom 13%-a, a LINE felhasználásával szaporodik Egyebek Humán génduplikációk (pszeudogének) Egyszerű ismétlések (pl. AAAAAAAAAAAAAA….)

40 A humán gének statisztikai adatai
Exonok átlagos hossza humán Intronok átlagos hossza humán Hozzávetőleges adatok: A legtöbb exon bp hosszú 7-9 exon/gén intron: bp Domain-ek száma a fehérjékben A humán fehérjék domain szerkezetében igen nagy a variabilitás Humán

41 ‘Periódusos rendszer’ A humán fehérjék listája
Gén és fehérje indexek ‘Orvos-biológiai ‘Periódusos rendszer’ A humán gének listája A humán fehérjék listája

42 Fehérje adatbázisok: HPRF

43 Orvosi alkalmazások 1. Öröklődő betegségekért felelős gének azonosítása Monogénes rendszerek: Legalább 30 betegséget azonosítottak 2000-ben: pl. Teljes színvakság (CNGA3 gén) (cGMP függő csatorna) Poligénes rendszerek: “association studies”

44 Cumulative Pace of Disease Gene Discovery ( ). The number of disease genes identified so far is 1,485. Data provided by Online Mendelian Inheritance in Man.

45 Gyógyszeripar Új gyógyszer-támadáspontok felfedezése ‘in silicio’ Pl.:
Szerotonin receptor ismert gén: 5-HT3A új gén (homológ szekvencia): 5-HT3B A kettő együtt alkot egy hatékony szerotonin receptort Pl.: Szekvenciaelemek, melyekre ismert gyógyszerek hatnak Van-e hasonló szekvencia a névtelen gének között ??? Új fehérjék, melyekre hatnak az ismert gyógyszerek

46 Hogyan tovább?

47 Hogyan tovább?

48 Hogyan tovább?

49 1999: Mouse Genome Sequencing Network, NIH (2003)
Nature, 2001 oct. (413)

50

51